基因改组EGF抗原与VEGF抗原联合免疫治疗乳腺癌的研究

发布时间：2018-05-03 06:21

本文选题：DNA + shuffling　；参考：《华中农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)及表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)在许多上皮来源的肿瘤中过表达,提供肿瘤细胞生长、转移所必须的信号。以EGF及EGFR为靶标的抗肿瘤疫苗已成为当前肿瘤免疫治疗的主要研究方向。如何增强EGF蛋白的免疫原性,打破机体对EGF蛋白的免疫耐受,是研发EGF疫苗的关键所在。本研究中,我们通过DNA shuffling技术,重组人、小鼠和鸡的EGF外显子片段,得到融合多物种的EGF重组蛋白。免疫小鼠后,诱导小鼠产生抗EGF抗体,阻断EGF/EGFR细胞信号通路,抑制肿瘤生长。并探究了重组EGF疫苗与重组血管内皮生长因子(VEGF)疫苗联合免疫的抗肿瘤效果。主要方法与结果如下:(1)通过PCR扩增人、小鼠和鸡的EGF外显子片段,然后用DNaseⅠ酶将扩增得到的基因切成50bp左右的小片段。将得到的小片段混合,并互为模板和引物进行PCR扩增即进行DNA shuffling重组,然后用带酶切位点的人、小鼠和鸡的EGF基因引物扩增DNA shuffling产物。将扩增得到的产物分段回收并进行双酶切,插入到载体pET-32a,然后转化到大肠杆菌BL21中,得到含400个转化子的重组EGF文库。通过菌落PCR和SDS-PAGE筛选得到22个表达重组蛋白的转化子,将筛选得到的转化子诱导表达蛋白并免疫小鼠,进一步筛选得到6个能诱导小鼠产生对小鼠EGF蛋白(mEGF)和人EGF蛋白(hEGF)均能产生较高抗体效价的转化子。(2)纯化筛选得到的6个转化子重组蛋白,与MF59佐剂混合后免疫小鼠进行抗肿瘤(小鼠乳腺癌)免疫的研究。结果发现300号和380号两种重组蛋白有免疫抗瘤活性,荷瘤后15天剥瘤称重,PBS组及PBS混合MF59佐剂组的平均瘤重分别为0.372 g和0.258 g,而300号与380号重组蛋白免疫组的平均瘤重仅为0.072 g和0.038g,显著(P0.01)低于PBS对照组。进一步研究发现300号和380号重组蛋白诱导小鼠产生的抗mEGF抗体效价分别可达3200倍和6400倍。综合考虑,380号重组蛋白可诱导更强的免疫应答,产生更高效价的抗EGF抗体,具有更好的免疫抗瘤效果,可显著抑制肿瘤的生长和延长荷瘤小鼠的生存期。经Western Blotting验证,380号重组蛋白免疫诱导的抗体与人EGF、小鼠EGF和380重组蛋白均能特异性结合。(3)筛选得到的380号重组EGF蛋白疫苗与重组VEGF蛋白疫苗联合免疫,可诱导小鼠同时产生抗EGF抗体和抗VEGF抗体,抗体效价分别达到12800倍和6400倍。联合免疫优于单一EGF疫苗或VEGF疫苗的免疫治疗效果,与单一免疫治疗相比,联合免疫能更好地抑制小鼠肿瘤(4T1乳腺癌)的生长和延长荷瘤小鼠的生存时间。综上所述,DNA shuffling技术可有效重组肿瘤抗原,增强肿瘤抗原的免疫原性,打破机体对自身蛋白的免疫耐受。380号重组EGF蛋白能诱导小鼠产生对小鼠EGF和人EGF都具有特异性的高效价抗体,阻断EGF/EGFR细胞信号通路,抑制4T1乳腺癌细胞生长。通过与重组VEGF蛋白疫苗的联合免疫,探究了肿瘤疫苗联合免疫的可行性,为肿瘤免疫治疗提供了新的方向和思路。
[Abstract]:The results were as follows : ( 1 ) The results were as follows : ( 1 ) The results were as follows : ( 1 ) Using EGF and EGFR as target , we obtained the recombinant EGF library . The results were as follows : ( 1 ) The recombinant EGF gene was amplified by PCR , and then transformed into E . coli BL21 . The results showed that the anti - EGF antibody and anti - VEGF antibody could induce the growth of tumor antigen and to prolong the survival time of tumor - bearing mice .

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.51

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