烟草NtCIPK23基因的克隆、表达分析及转基因过量表达研究

  钙调磷酸酶B类似蛋白的互作蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）是作为下游蛋白与活化的钙调磷酸酶B类似蛋白CBL（Calcineurin B-like proteins）相互作用的一类蛋白。二者的相互作用能将植物Ca2+信号传递下去,而Ca2+作为细胞内重要的第二信使在植物对抗各种非生物胁迫的防御机制中起着重要的作用。研究表明，CIPK基因家族蛋白广泛参与植物的逆境胁迫应答和生长发育调控，非生物胁迫（Abiotic stresses）因子如干旱、高盐和低钾等都能引起植物CIPK基因的上调表达，其中拟南芥CIPK23基因蛋白在钾离子代谢中有重要作用。目前，对CIPK基因功能的研究主要集中在拟南芥和水稻中，最近几年，随着大规模植物基因组测序的完成，在杨树、豌豆和苜蓿等植物中对CIPK基因的研究也越来越深入。烟草是一种重要的模式植物与农业经济作物，对烟草CIPK基因的研究无论是在基础理论研究领域，还是在通过遗传育种指导生产实践领域都具有积极的意义。本研究从烟草中克隆获得一个新的CIPK基因，命名为NtCIPK23。通过基因序列结构分析、逆境胁迫的表达特征检测和转基因过表达分析，对NtCIPK23的功能进行了初步的探索。主要工作如下：①结合生物信息学分析方法，克隆获得NtCIPK23基因orf编码区序列，总长度1350bp，GC含量为42.13%，与蓖麻、杨树的部分CIPK基因序列相似度在80%以上。NtCIPK23基因编码450个氨基酸残基，预测的蛋白质分子量为50.702kD，等电点为9.18，亲水性的总平均值为-0.3751。比较基因组学分析发现NtCIPK23对应的蛋白序列在N端蛋白激活结构域和C端NAF结构域比较保守。②半定量RT-PCR分析表明，NtCIPK23基因在转录水平受干旱胁迫强烈的诱导。在高盐和SA的胁迫下，NtCIPK23的表达呈现出先升高再降低的趋势，表明NtCIPK23也受这两种胁迫的诱导表达。但是在冷胁迫下，NtCIPK23并没有表现出明显的受诱导表达模式。③为进一步的探索NtCIPK23的功能，本研究将NtCIPK23构建到植物超表达TA克隆载体pCXSN中，构建成CaMV35S启动子驱动的双元载体pCXSN-35S:NtCIPK23。通过电转化的方法，将该载体质粒转入根瘤农杆菌LBA4404中，并通过质粒PCR以及测序证实获得阳性克隆。采用叶盘转化法进行转基因操作，经抗性筛选、TAIL-PCR和半定量RT-PCR鉴定证实获得转基因株系，抗逆相关基因在转基因植株中的表达水平较野生型高，为后续的研究奠定了坚实的基础。

 

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页数：62

 

【学位级别】：硕士

 

文章目录

摘要

ABSTRACT

1 文献综述

    1.1 植物钙信号系统研究进展

        1.1.1 CaM/CML 信号系统

        1.1.2 CDPK 信号系统

        1.1.3 CBL-CIPK 信号系统

2 引言

    2.1 研究目的及意义

    2.2 主要研究内容

    2.3 研究技术路线

3 烟草 NtCIPK23 基因的克隆与分析

    3.1 实验材料与试剂

        3.1.1 实验材料

        3.1.2 实验试剂

    3.2 实验方法与步骤

        3.2.1 NtCIPK23 基因的电子克隆

        3.2.2 材料处理

        3.2.3 总 RNA 的提取

        3.2.4 RNA 的消化

        3.2.5 反转录反应

        3.2.6 cDNA 检测

        3.2.7 NtCIPK23 基因的 PCR 扩增

        3.2.8 NtCIPK23 基因目的片段的回收

        3.2.9 连接反应

        3.2.10 连接产物的转化

        3.2.11 重组质粒的 PCR 鉴定与测序

        3.2.12 半定量 RT-PCR 分析

    3.3 实验结果与分析

        3.3.1 烟草叶片总 RNA 的提取及检测

        3.3.2 烟草 NtCIPK23 的克隆与序列分析

        3.3.3 烟草 NtCIPK23 的表达分析

    3.4 讨论

4 烟草 NtCIPK23 转基因

    4.1 实验材料与试剂

    4.2 实验方法与步骤

        4.2.1 NtCIPK23 超表达载体的构建

        4.2.2 农杆菌感受态的制备

        4.2.3 表达载体转化农杆菌

        4.2.4 转基因的操作流程

        4.2.5 转基因植株的生物学鉴定分析

    4.3 实验结果与分析

        4.3.1 NtCIPK23 超表达载体的构建

        4.3.2 转基因植株的生物学鉴定分析

    4.4 讨论

5 总结与展望

致谢

参考文献

附录

    A. 发表的论文

    B. 待发表的论文

    C. 参加的研究课题

    D. 缩略词表

 

期刊论文

 

[1]植物CBL/CIPK网络系统逆境应答研究进展[J]. 赵晋锋,余爱丽,王高鸿,田岗,王寒玉,杜艳伟,常海霞.  中国农业科技导报. 2011(04)

[2]Identification and characterization of putative CIPK genes in maize[J]. Xifeng Chen~a,Zhimin Gu~b,Dedong Xin~b,Liang Hao~b,Chengjie Liu~b,Ji Huang~a, Bojun Ma~b,Hongsheng Zhang~(a,*) a State Key Lab of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China b College of Chemistry and Life Sciences,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China.  遗传学报. 2011(02)

[3]浅谈烟草钾素营养[J]. 刘岱松,杨朝辉,石方斌,许树银,张友臣,明安祥.  农业科技通讯. 2011(01)

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[5]植物中CBL-CIPK途径转导特异Ca2+信号的分子机制[J]. 张成伟,王天宇,黎裕.  植物遗传资源学报. 2010(04)

[6]植物抗逆基因研究进展[J]. 杨柳,张振乾,宋继金,谭太龙,官春云,刘忠松.  作物研究. 2010(02)

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