太子参皂苷合成关键酶HMGR基因的克隆与转化烟草研究

发布时间：2017-04-08 05:24

  本文关键词：太子参皂苷合成关键酶HMGR基因的克隆与转化烟草研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：太子参系石竹科草本植物异叶假繁缕的块根,在临床上用于多种经典补益配方,亦是多种中成药的重要成分之一,有抗疲劳、抗应激、增强免疫力等药理作用,是福建省最具特色的大宗道地药材之一。皂苷(Saponin)是皂苷或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷,是植物体内重要的次生代谢产物,其主要功能是参与植物防御反应,以抵御病原物和草食动物的危害。太子参皂苷是太子参中主要药效成分,具有抗疲劳、耐缺氧、耐低温作用,能增加免疫器官的重量,并能激活网状内皮系统的吞噬功能。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是植物皂苷主要的合成途径——甲羟戊酸途径(MVA途径)中催化HMG-CoA还原形成甲羟戊酸(MVA)限速酶,该反应不可逆,被认为是MVA途径的第一个限速反应,具有重要意义。通过太子参HMGR基因编码序列的克隆和功能研究有助于理解太子参皂苷的合成与代谢相关研究,提高其皂苷含量,创造良好经济效益。目前对太子参的研究主要集中于栽培和常规育种方面,相关的分子生物学研究不够深入,特别是关于其活性成分分子调控机制的研究目前还是空白。本研究以太子参拓参1号为植物材料,通过RACE技术克隆HMGR全长cDNA序列,构建其重组表达载体,转化烟草K326品种中,并对转基因植株的HMGR酶活及总皂苷含量测定与分析。主要研究结果如下：(1)通过提取太子参总RNA,利用RACE和RT-PCR等技术对太子参皂苷合成途径中的关键酶基因HMGR进行分离鉴定,获得到一条长度2137bp的序列,该序列含一个1674 bp的可译阅读框,编码557个氨基酸残基,相对分子质量为59.327 kDa,等电点(pI)值为7.58。经相似性分析,源于太子参HMGR的氨基酸序列与人参HMGR的一致性为76.7%,与拟南芥HMGR的一致性为77.7%,与刺五加HMGR、萝卜HMGR的一致性为77.1%,推测获得的序列为太子参HMGR侯选基因。(2)将获得的HMGR基因ORF序列与真核表达载体pRi 101-AN进行连接,获得重组质粒pRi-HMGR,通过农杆菌转化法浸染烟草K326,经PCR检测,共获得阳性转基因植株30株,转化率为93.75%。(3)利用微波处理等方法提取转HMGR烟草与非转基因植株培养基中的总皂苷,通过香草醛-高氯酸反应体系法测定皂苷含量,结果表明,种植转HMGR烟草分泌到培养基中的皂苷类物质的含量明显高于非转基因烟草,最高达16.64%,约为非转基因植株的两倍,表明外源HMGR在烟草中得到表达,并提高了烟草总三萜的含量。(4)论文对HMGR酶活测定体系进行了优化,并对转HMGR烟草与非转基因烟草植株的HMGR酶活进行了测定,结果表明,HMGR酶的最适温度为26℃,最适pH为6.0,且样品在紫外光下处理45 min仍可保持一定酶活性。转HMGR烟草的HMGR酶活力明显高于非转基因烟草,转HMGR烟草转录表达的酶活力高达0.036单位,是非转基因烟草对照的三倍。
【关键词】：太子参 基因克隆 皂苷 MVA HMGR
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1 文献综述11-21
• 1.1 太子参概述11
• 1.2 太子参的主要活性成分11-14
• 1.2.1 氨基酸11-12
• 1.2.2 多糖12-14
• 1.2.3 微量元素14
• 1.3 苷类14-18
• 1.3.1 皂苷的功效14
• 1.3.2 合成途径14-15
• 1.3.3 苷类合成关键酶15-17
• 1.3.4 皂苷研究17-18
• 1.4 太子参成分研究方法18-19
• 1.4.1 质谱法18
• 1.4.2 色谱法18-19
• 1.5 太子参其他研究及展望19-20
• 1.6 研究目的及意义20-21
• 2 材料与方法21-29
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 植物材料、菌株及质粒21
• 2.1.2 药品与试剂21
• 2.1.3 仪器21
• 2.1.4 培养基21-22
• 2.1.5 溶液配置22-23
• 2.2 方法23-29
• 2.2.1 太子参HMGR全长cDNA的分离及表达载体构建23-25
• 2.2.2 转HMGR烟草的培育与检测25-26
• 2.2.3 转HMGR烟草总三萜提取与含量测定26-27
• 2.2.4 转HMGR烟草中HMGR酶活性分析27-29
• 3 结果与分析29-47
• 3.1 太子参HMGR基因的克隆与表达载体构建29-34
• 3.1.1 太子参总RNA的提取与检测29
• 3.1.2 太子参HMGR基因3’端和5’端的PCR扩增29-30
• 3.1.3 太子参HMGR基因生物信息学分析30-33
• 3.1.4 重组表达载体的构建与检测33-34
• 3.2 转HMGR烟草培育与检测34-37
• 3.2.1 转HMGR烟草的培育34-35
• 3.2.2 转HMGR烟草PCR鉴定35-37
• 3.2.3 转HMGR烟草RT-PCR鉴定37
• 3.3 转HMGR烟草总三萜提取测定37-41
• 3.3.1 Rb1标准曲线绘制37-38
• 3.3.2 烟草总三萜含量对比38-41
• 3.4 HMGR酶活性检测分析41-47
• 3.4.1 蛋白浓度标准曲线图41-42
• 3.4.2 HMGR酶活性分析与物理条件的影响42-47
• 4 讨论47-49
• 结论49-51
• 参考文献51-59
• 附录Ⅰ 实验缩写中英文对照59-60
• 附录Ⅱ 实验部分所用培养基配方60-61
• 附录Ⅲ 实验部分图示61-66
• 致谢66

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1 郑鹏;化文平;王U喼，

本文编号：292179