滇重楼SE、HMGR和FPS基因的克隆及原核表达研究

发布时间：2017-04-09 13:00

  本文关键词：滇重楼SE、HMGR和FPS基因的克隆及原核表达研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的克隆滇重楼甾体皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(SE)基因、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因和法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测c DNA样本中SE1基因、SE2基因、HMGR基因和FPS基因的相对含量。方法以昆明市梁王山采摘的滇重楼根茎为材料,提取其总RNA,再反转录为c DNA。以反转录得到的c DNA为模板,根据Hi Seq2500 sequencing platform得到的滇重楼转录组数据中的两组SE基因、HMGR基因和FPS基因全长序列设计特异性引物,克隆SE基因、HMGR基因和FPS基因,再将克隆得到的基因片段转入到p EASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基进行自动诱导表达,并用Real-time PCR法检测c DNA样本中SE1、SE2、HMGR和FPS基因相对含量。结果获得了两条滇重楼SE基因,将它们分别命名为SE1、SE2基因,全长分别为1932bp、1828bp。SE1的ORF长为1578bp,编码525个氨基酸,SE2的ORF长为1548bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示SE1基因在茎和叶中的表达与SE2基因相比较具有显著差异,SE1的表达在叶中最为显著。获得了一条滇重楼HMGR基因,全长1731bp,ORF为1593bp,编码531个氨基酸。荧光定量PCR结果表明HMGR基因在根中的表达量高于茎和叶。获得了一条滇重楼的FPS基因,全长为1206bp,并且包含完整的ORF,大小为1050bp,编码350个氨基酸。荧光定量PCR结果显示,FPS基因在叶中的表达量较高。测序结果表明,原核表达载体p EASY-E1-SE、p EASY-E1-HMGR和p EASY-E1-FPS构建成功。SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE1、SE2、HMGR和FPS基因并获得了相对应的四种融合蛋白。结论SE1基因和SE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,且可能在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。HMGR基因在根中的高表达以及FPS基因在叶中的高表达等结果,为滇重楼功能基因表达分析研究及人工调控滇重楼有效成分的生物合成奠定了基础。
【关键词】：滇重楼 SE HMGR FPS 基因克隆 原核表达 荧光定量 PCR
【学位授予单位】：云南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.239
【目录】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 缩略词表11-13
• 引言13-15
• 第一章 滇重楼SE基因cDNA全长的获取及原核表达15-46
• 1 研究目的和意义15
• 2 材料、仪器和试剂15-16
• 2.1 材料15
• 2.2 仪器15-16
• 2.3 试剂16
• 3 实验方法16-23
• 3.1 滇重楼SE基因cDNA全长的获得16-21
• 3.1.1 滇重楼根的总RNA提取16-17
• 3.1.2 滇重楼SE基因cDNA的合成17-18
• 3.1.3 滇重楼SE基因的PCR扩增18-19
• 3.1.4 滇重楼SE基因的克隆及载体构建19-21
• 3.2 滇重楼SE基因的原核表达21-22
• 3.2.1 滇重楼SE基因原核表达载体的构建与鉴定21
• 3.2.2 滇重楼SE基因原核表达载体的诱导表达21
• 3.2.3 原核表达后总蛋白的提取21-22
• 3.3 滇重楼SE基因的荧光定量PCR实验22-23
• 3.3.1. 利用Primer Premier 5.0 软件设计引物22
• 3.3.2 滇重楼SE基因cDNA的获得22
• 3.3.3 PCR反应步骤22-23
• 4 结果与讨论23-44
• 4.1 滇重楼SE基因cDNA全长的获得23-34
• 4.1.1 滇重楼根组织总RNA质量检测23-24
• 4.1.2 滇重楼SE基因的克隆与序列分析24-34
• 4.2 滇重楼SE基因的原核表达结果34-40
• 4.2.1 重组表达载体pEASY-E1-SE的构建与鉴定结果34
• 4.2.2 重组表达载体pEASY-E1-SE的诱导表达34-40
• 4.3 滇重楼SE基因荧光定量PCR实验结果40-44
• 5 讨论44-46
• 第二章 滇重楼HMGR基因的cDNA全长的获取及原核表达46-63
• 1 研究目的和意义46
• 2 材料、仪器和试剂46-47
• 2.1 材料46-47
• 2.2 仪器47
• 2.3 试剂47
• 3 实验方法47-51
• 3.1 滇重楼HMGR基因cDNA全长的获得47-49
• 3.1.1 滇重楼根的总RNA提取与cDNA合成47
• 3.1.2 滇重楼HMGR基因 3’RACE实验47-49
• 3.1.3 滇重楼HMGR基因的克隆49
• 3.2 滇重楼HMGR基因的原核表达49-50
• 3.2.1 滇重楼HMGR基因原核表达载体的构建与鉴定49-50
• 3.2.2 滇重楼HMGR基因原核表达载体的诱导表达50
• 3.2.3 原核表达后总蛋白的提取50
• 3.3 滇重楼HMGR基因的荧光定量PCR实验方法50-51
• 4 结果51-62
• 4.1 滇重楼HMGR基因cDNA全长的获得51-60
• 4.1.1 滇重楼根组织总RNA质量检测51
• 4.1.2 3’RACE实验PCR电泳与回收51-52
• 4.1.3 滇重楼HMGR基因的克隆52-60
• 4.2 滇重楼HMGR基因的原核表达结果60-61
• 4.2.1 重组表达载体pEASY-E1-HMGR的构建与鉴定结果60
• 4.2.2 重组表达载体pEASY-E1-SE的诱导表达60-61
• 4.3 滇重楼HMGR基因荧光定量PCR结果61-62
• 5 讨论62-63
• 第三章 滇重楼FPS基因cDNA全长的获取及原核表达63-77
• 1 研究目的和意义63
• 2 材料、仪器和试剂63-64
• 2.1 材料63
• 2.2 仪器63
• 2.3 试剂63-64
• 3 实验方法64-66
• 3.1 滇重楼FPS基因cDNA全长的获得64-65
• 3.1.1 滇重楼根的总RNA提取与cDNA合成64
• 3.1.2 滇重楼FPS基因的克隆与序列分析64-65
• 3.2 滇重楼FPS基因的原核表达65-66
• 3.2.1 滇重楼FPS基因原核表达载体的构建与鉴定65
• 3.2.2 滇重楼FPS基因原核表达载体的诱导表达65
• 3.2.3 原核表达后总蛋白的提取65-66
• 3.3 滇重楼FPS基因的荧光定量PCR实验方法66
• 4 结果66-76
• 4.1 滇重楼FPS基因cDNA全长的获得66-73
• 4.1.1 滇重楼根组织总RNA质量检测66
• 4.1.2 滇重楼FPS基因的克隆与序列分析66-73
• 4.2 滇重楼FPS基因的原核表达73-74
• 4.2.1 重组表达载体pEASY-E1-FPS的构建与鉴定结果73
• 4.2.2 重组表达载体pEASY-E1-FPS的诱导表达73-74
• 4.3 滇重楼FPS基因的荧光定量PCR实验74-76
• 5 讨论76-77
• 参考文献77-80
• 综述80-98
• 药用植物中鲨烯环氧酶基因的研究进展80-90
• 参考文献88-90
• 滇重楼SE基因、HMGR基因和FPS基因研究进展90-98
• 参考文献95-98
• 攻读硕士期间发表的文章98-99
• 附录99-105
• 致谢105

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