蛋鸡感染基因Ⅶd亚型NDV后输卵管组织中病毒分布和Toll样受体表达及炎性细胞浸润研究

发布时间：2017-04-14 19:07

  本文关键词：蛋鸡感染基因Ⅶd亚型NDV后输卵管组织中病毒分布和Toll样受体表达及炎性细胞浸润研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽类的一种重要传染病。新城疫不仅能引起感染鸡的死亡,还导致蛋鸡产蛋量下降,畸形蛋、软壳蛋及沙壳蛋增多,表明鸡生殖道也是NDV的靶组织。流行病学的研究表明,在过去十年里,基因Ⅶ型新城疫病毒是包括中国在内亚洲鸡和鹅中暴发的主要基因型。近些年,大部分研究致力于基因ⅦNDV对免疫器官的损伤,但有关NDV感染蛋鸡输卵管病理损伤的研究很少。研究输卵管的局部免疫,尤其是天然免疫在基因Ⅶd亚型NDV感染后的作用,对于NDV感染导致蛋鸡输卵管功能障碍的致病机制研究至关重要。本研究采用滴鼻和点眼的方法,用基因Ⅶd亚型NDV人工感染40周龄蛋鸡,观察蛋鸡的临床症状及输卵管组织损伤;通过构建荧光定量PCR方法,检测不同感染时间输卵管各部分的病毒复制水平;HN蛋白免疫荧光染色观察病毒浸染输卵管细胞的类型;Real-time RT-PCR检测模式识别受体Toll样受体和MDA5的表达情况;以及不同感染时间膨大部CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴细胞浸润情况。试验结果如下:1.基因Ⅶd亚型NDV人工感染非免健康蛋鸡。感染后分别在第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、15 d颈部放血处死5只蛋鸡。按输卵管的伞部、膨大部、峡部、子宫部和阴道部取材。建立了NDV M基因real-time RT-PCR的标准曲线,相关系数达0.9979。参照建立的标准曲线,real-time RT-PCR检测了输卵管不同部位的病毒载量,发现输卵管5个部位均能检测到NDV,且在第5 d病毒载量最高,膨大部病毒载量达8918.6 copies/μL,子宫部达2934.6 copies/μL。NDV HN蛋白染色在感染鸡的输卵管5个部位都为阳性,且固有层细胞和黏膜层细胞均受到病毒的侵染。2.HE染色发现蛋鸡感染基因Ⅶd亚型NDV后,输卵管组织膨大部和子宫部出现严重的病理变化。膨大部的腺体出现充血出血,甚至腺体开始溶解,黏膜层开始变薄。子宫部的腔上皮管状腺水肿,固有层淋巴细胞浸润,黏膜上皮细胞出现坏死,脱落。用荧光定量方法检测NDV感染蛋鸡后输卵管膨大部和子宫部的天然免疫模式识别受TLR3/7/21和MDA5基因mRNA在感染后不同时间的表达变化,结果发现在膨大部和子宫部都呈现出上调的趋势,其中膨大部TLR3/7/21 mRNA表达在蛋鸡感染后第5 d达到峰值,升高的倍数分别达42.6,98.9和27.1倍。3.免疫荧光染色观察CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴细胞在输卵管膨大部浸润情况。结果表明,NDV感染组CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴细胞在膨大部明显多于健康对照组,CD3+CD8α+和CD3+CD4+淋巴细胞在感染第1 d后开始增多,分别在感染后第3 d和第5 d达到最多。CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴细胞主要分布在膨大部的固有层和黏膜上皮。CD4+主要分布在固有层,CD8α+主要分布在黏膜上皮,而且CD8α+比CD4+更能渗透到黏膜上皮的底部。综上所述,蛋鸡感染基因Ⅶd亚型NDV后,病毒能够侵染输卵管不同部位复制,引起输卵管发生严重病理损伤。本研究结果为揭示NDV感染导致产蛋鸡输卵管功能障碍和产蛋下降提供了一定的理论依据。
【关键词】：基因Ⅶd亚型NDV 输卵管组织 Toll样受体 淋巴细胞浸润 产蛋鸡
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 文献综述12-21
• 第一章 家禽对新城疫病毒的免疫反应研究进展12-21
• 1.1 新城疫病毒的概述12
• 1.2 NDV的一般生物学特性12-14
• 1.2.1 NDV的分类12-13
• 1.2.2 理化特性13
• 1.2.3 血凝活性和神经氨酸酶活性13
• 1.2.4 NDV基因组结构及主要编码蛋白13-14
• 1.3 NDV的致病机理14
• 1.3.1 致病性的分子基础14
• 1.3.2 强毒株的出现14
• 1.4 家禽对NDV免疫反应14-19
• 1.4.1 天然免疫反应15-17
• 1.4.1.1 模式识别受体15-16
• 1.4.1.2 天然免疫因子16-17
• 1.4.2 体液免疫17-18
• 1.4.3 细胞免疫18-19
• 1.5 鸡输卵管结构与功能19-20
• 1.6 本研究目的意义20-21
• 试验研究21-41
• 第二章 蛋鸡感染基因VIId NDV后输卵管组织中病毒载量及分布研究21-32
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 毒株21
• 2.1.2 试验动物21
• 2.1.3 主要试剂21-22
• 2.1.4 主要仪器22
• 2.2 方法22-26
• 2.2.1 病毒增殖22-23
• 2.2.2 测定病毒的EID_(50)23
• 2.2.3 蛋鸡人工感染基因VIId NDV及临床症状观察23
• 2.2.4 NDV M基因real-time RT-PCR标准曲线的建立23-25
• 2.2.4.1 引物的设计及合成23
• 2.2.4.2 阳性重组质粒的制备23-25
• 2.2.4.3 标准曲线的建立25
• 2.2.5 基因VIId NDV感染蛋鸡输卵管组织中不同部位病毒载量的检测25-26
• 2.2.5.1 输卵管部位总RNA的提取25
• 2.2.5.2 cDNA的合成25
• 2.2.5.3 Real-time RT-PCR25
• 2.2.5.4 数据的统计分析25-26
• 2.2.6 免疫荧光染色检测NDV感染蛋鸡输卵管组织中HN蛋白26
• 2.2.6.1 石蜡切片的制作26
• 2.2.6.2 HN蛋白的荧光染色26
• 2.3 结果26-30
• 2.3.1 基因VIId NDV感染蛋鸡临床症状及病变观察26-27
• 2.3.2 NDV M基因标准曲线的建立27-29
• 2.3.2.1 基因VIId NDV M基因RT-PCR扩增结果27
• 2.3.2.2 基因VIId型NDV M基因的克隆27-28
• 2.3.2.4 标准曲线的建立28-29
• 2.3.3 蛋鸡输卵管不同部位中NDV病毒载量的测定29
• 2.3.4 NDV病毒HN蛋白在输卵管5个部位的分布情况29-30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 小结31-32
• 第三章 蛋鸡感染基因VIId NDV后输卵管组织中Toll样受体表达及炎性细胞的浸润研究32-41
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 毒株和试验动物32
• 3.1.2 主要试剂32-33
• 3.2 方法33-34
• 3.2.1 NDV感染蛋鸡输卵管膨大部和子宫部病理组织学检测33
• 3.2.2 Real-time RT-PCR检测Toll样受体及MDA5基因的表达33
• 3.2.2.1 Real-time RT-PCR33
• 3.2.2.2 数据的统计分析33
• 3.2.3 直接免疫荧光检测CD3CD4和CD3CD8淋巴细胞的浸润33-34
• 3.2.3.1 结果的判定34
• 3.3 结果34-39
• 3.3.1 感染蛋鸡输卵管膨大部和子宫部病变情况34-35
• 3.3.2 Toll样受体和MDA5基因在输卵管膨大部和子宫部表达变化35-36
• 3.3.3 CD~(3+)CD~(4+)和CD~(3+)CD8α~+淋巴细胞在NDV感染鸡输卵管膨大部的分布36-39
• 3.4 讨论39-40
• 3.5 小结40-41
• 结论41-42
• 参考文献42-48
• 附录48-51
• 缩略词表51-52
• 致谢52-53
• 作者简介53

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本文编号：306636