稻瘟病菌MoSom1剪切异构体、PKA磷酸化位点及含LisH模体蛋白编码基因的功能分析

发布时间：2017-04-14 16:12

  本文关键词：稻瘟病菌MoSom1剪切异构体、PKA磷酸化位点及含LisH模体蛋白编码基因的功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：稻瘟病是世界水稻产区最重要的病害之一,而稻瘟病菌是研究植物与病原互作的模式病原真菌。了解稻瘟病菌的致病分子机理对杀菌剂的研发和病害的有效防控具有重要意义。本实验室先前的研究发现,稻瘟病菌转录调控因子MoSoml作用于cAMP-PKA信号途径下游,调控稻瘟病菌的形态分化和致病过程。本文对稻瘟病菌MoSom1剪切异构体、PKA磷酸化位点及含LisH模体蛋白编码基因的功能进行了较为系统的研究,取得以下结果：1.稻瘟病菌MoSom1不同剪切异构体具有相同的生物学功能。用MoSOM1的6种不同剪切方式序列回补Δmosom1突变体的结果显示,不同剪切方式回补转化子的生长、产孢和致病性均能恢复到野生型水平,可见,MoSOM1的不同剪切方式不影响其正常的生物学功能。2.稻瘟病菌MoSom1的S227氨基酸残基是一个关键的PKA磷酸化位点。生物信息学分析显示,稻瘟病菌MoSom1中含8个预测的PKA磷酸化S/T残基,分别为T151、S188、S227、S228、S512、T603、T629和S642。对这些残基的缺失突变结果显示,只有MoSOM1ΔS227,228缺失突变体表型和致病性不能恢复到野生型。进一步对S227和S228的替换(A or E)突变结果显示,MoSOM1S227E、MoSOM1S228A和MoSOM1S228E的表型与野生菌株一致,而MoSOM1S227A的表型和致病性不能恢复。上述结果证实,稻瘟病菌MoSoml的S227残基是一个关键的PKA磷酸化位点。3.稻瘟病菌中编码含LisH模体蛋白基因的功能分析。稻瘟病菌MoSoml含一个保守的LisH模体。生物信息学分析发现,在稻瘟病菌基因组中总共有7个含LisH模体蛋白的编码基因,除已报道的MGG_04708 (MoSOMl)和MGG_03198 (TIGI)外,其余的MGG_01665、MGG_06742、 MGG_00753、MGG_04137和MGG_09369还未见有研究报道,为探索这些基因的生物学功能,我们展开了对上述5个基因的敲除工作。目前已分别获得MGG_01665、MGG_00753和MGG 04137基因的敲除突变体,ΔMGG_01665和ΔMGG_04137突变体的表型(包括生长、形态分化和致病力)与野生型菌株相似,而ΔMGG_00753突变体对寄主的致病力有一定下降。经过二十多次对MGG 06742和MGG 09369基因敲除的原生质体转化实验,分别获得五百多个和两百多个转化子,但未能鉴定到这两个基因的敲除突变体,因此,初步判断它们可能是稻瘟病菌生存不可缺少的基因。4.稻瘟病菌MoSoml互作蛋白的初步筛选。利用亲和纯化的方法获得可能与MoSoml互作的混合蛋白样品,LC/MS分析结果显示候选互作蛋白有1101个,根据功能可将其归为23个不同类别,其中与信号转导途径相关的有37个。进一步分析显示,这37个候选蛋白中包含MAPK信号途径中的组件如Pmk1 (MGG_09565)、Mkk2 (MGG_06482)、Ras1 (MGG_06154)等。后续有待用酵母双杂交(Y2H)实验进一步验证这些候选蛋白是否能在体外条件下与MoSoml互作,进而探究稻瘟病菌cAMP-PKA途径和MAPK途径下游的cross talk。
【关键词】：稻瘟病菌 MoSom1 剪切异构体 磷酸化位点 LisH模体
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.111.41
【目录】：

• 致谢8-9
• 摘要9-11
• Abstract11-16
• 第一章 文章综述16-30
• 1 稻瘟病与稻瘟病菌16-19
• 1.1 稻瘟病16-17
• 1.2 稻瘟病菌的侵染循环17-19
• 2 cAMP-PKA信号途径19-24
• 2.1 酵母cAMP-PKA信号途径研究进展20-22
• 2.2 稻瘟病菌cAMP-PKA信号途径研究进展22-24
• 3 转录因子Flo8和LisH模体的研究进展24-27
• 3.1 Flo8概况24-26
• 3.2 LisH模体概况26-27
• 4 本研究的目的与意义27-30
• 第二章 材料与方法30-50
• 1 实验材料30-34
• 1.1 供试菌株30
• 1.2 供试质粒载体30
• 1.3 供试植物30
• 1.4 供试试剂30-31
• 1.5 供试抗生素31
• 1.6 培养基及配方31-34
• 2 实验方法34-50
• 2.1 常规PCR反应34-35
• 2.2 DNA操作35-39
• 2.2.1 大肠杆菌质粒DNA的提取35-36
• 2.2.2 快速小量抽提稻瘟病菌基因组DNA36
• 2.2.3 CTAB法大量抽提稻瘟病菌基因组DNA36-37
• 2.2.4 DNA的酶切37
• 2.2.5 DNA的琼脂糖凝胶电泳37-38
• 2.2.6 DNA的凝胶回收38
• 2.2.7 片段DNA连接载体反应38-39
• 2.2.8 质粒DNA的大肠杆菌感受态细胞转化39
• 2.3 RNA操作39-40
• 2.3.1 稻瘟病菌总RNA的提取39-40
• 2.3.2 cDNA的合成40
• 2.4 稻瘟病菌基因的敲除及互补40-43
• 2.4.1 敲除策略及敲除载体的构建40-41
• 2.4.2 互补策略及互补载体的构建41-42
• 2.4.3 稻瘟病菌原生质体的制备及转化42-43
• 2.5 稻瘟病菌基因组的Southern Blot(地高辛标记法)43-46
• 2.5.1 基因组的酶切、电泳及变性43
• 2.5.2 转膜43-44
• 2.5.3 DIG标记DNA探针及杂交液的准备44
• 2.5.4 预杂交44-45
• 2.5.5 杂交45
• 2.5.6 印记膜的洗涤45
• 2.5.7 免疫显色45-46
• 2.6 蛋白操作46-50
• 2.6.1 稻瘟病菌总蛋白的提取46
• 2.6.2 Western Blot46-48
• 2.6.3 目标蛋白的亲和纯化48-50
• 第三章 结果与分析50-63
• 1 MoSom1不同剪切异构体的功能分析50-53
• 2 MoSom1的PKA磷酸化位点功能分析53-58
• 2.1 MoSom1 PKA磷酸化位点的生物信息学初步预测53-54
• 2.2 预测位点缺失载体的构建54
• 2.3 点缺失转化子的获得及表型分析54-56
• 2.4 T151、S227和S228丙氨酸和谷氨酸替换载体的构建56
• 2.5 MoSOM1~(T151A/E)、MoSOM1~(S227A/E)和MoSOM1~(S228A/E)替换转化子的获得及表型分析56-58
• 3 稻瘟病菌含LisH模体蛋白编码基因的敲除58-61
• 3.1 稻瘟病菌中含LisH模体蛋白编码基因的生物信息学分析58-59
• 3.2 MGG_01665、MGG_04137和MGG_00753的敲除59
• 3.3 MGG_06742和MGG_09369的敲除59-61
• 4 MoSom1互作蛋白的初步筛选61-63
• 第四章 全文总结与讨论63-66
• 参考文献66-72
• 附录172-75
• 附录275

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