家蚕杆状病毒多角体启动子结合蛋白筛选及39k基因功能研究

发布时间：2017-05-04 17:11

  本文关键词：家蚕杆状病毒多角体启动子结合蛋白筛选及39k基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：多角体基因是家蚕杆状病毒(BmNPV)极晚期表达基因,因其启动子的超高效的启动功能,常被当作昆虫杆状病毒表达系统中启动外源基因表达的启动子,但其高效启动机制还鲜见报道。因此,在前期研究中,我们将多角体启动子序列作为诱饵,利用酵母单杂交筛选出了多种能与多角体启动子相互作用的蛋白因子,包括38K、39K、LEF5、P6.9、ORF60、ORF61、FP25、GP64、V-CATH。为进一步检测上述蛋白因子对BmNPV多角体启动子的调控作用,构建了由BmNPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶检测系统,通过定量检测萤光素酶活性的变化筛选出多角体启动子正调控因子LEF5,负调控因子39K和ORF61,其他因子调控作用不明显。39k同源基因存在于所有鳞翅目昆虫的杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白。迄今的研究表明,39k基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(BmNPV)39k基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚,为了深入了解该基因的功能,我们检测发现39k基因为早期转录基因,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和补回39k基因,构建了39k缺失型病毒39k-ko-Bacmid和修复型病毒39k-re-Bacmid,并分别转染BmN细胞,病毒滴度检测结果显示二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39k基因是BmNPV复制的非必需基因,但是该基因的缺失可显著降低病毒滴度。进一步利用荧光定量qPCR技术进行检测,发现39k基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显著影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显著下降(p0.01)。综上所述,利用双萤光素酶报告基因检测出多角体启动子正调控因子为LEF5,负调控因子为39K和ORF61,进一步研究可知39k基因是BmNPV复制的非必需基因,但该基因的缺失可显著降低病毒各时期基因的转录水平,本研究将为深入了解BmNPV 39k基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒表达系统高效转录机制的研究提供新基础。
【关键词】：家蚕杆状病毒 多角体基因启动子 结合蛋白 39k基因 基因敲除 双萤光素酶报告系统
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略语8-13
• 第一章 绪论13-17
• 1 杆状病毒研究现状13-15
• 1.1 杆状病毒简介13
• 1.2 杆状病毒调控基因研究概况13-14
• 1.3 家蚕杆状病毒表达系统简介14-15
• 2 Red同源重组技术15-16
• 3 双萤光素酶报告基因简介16-17
• 第二章 实验方案17-19
• 1 研究的目的和意义17
• 2 研究的主要内容17-18
• 3 技术路线18-19
• 第三章 家蚕杆状病毒多角体启动子结合蛋白的筛选19-41
• 1 材料与试剂19-20
• 1.1 材料19
• 1.2 试剂19-20
• 1.3 试剂配制20
• 2 方法20-33
• 2.1 双萤光素酶载体的构建20-26
• 2.1.1 重组转移载体p Fast Bac Dual-A3-Rluc的构建21-24
• 2.1.1.1 家蚕细胞基因组的提取21
• 2.1.1.2 重组转移载体p Fast Bac Dual-A3的构建21-23
• 2.1.1.3 重组转移载体p Fast Bac Dual-A3-Rluc的构建23
• 2.1.1.4 重组转移载体p Fast Bac Dual-A3-Rluc-polh-Fluc的构建23-24
• 2.1.2 双萤光素病毒载体wt-Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc的构建24-26
• 2.1.2.1 DH10Bac感受态细胞的制备24
• 2.1.2.2 供体质粒p Fast Bac Dual-A3-Rluc-polh-Fluc的转化24-25
• 2.1.2.3 双萤光素病毒载体wt-Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc的鉴定25-26
• 2.2 目的蛋白过表达载体的构建26-28
• 2.2.1 重组过表达载体的构建26-27
• 2.2.2 Western blotting检测筛选蛋白在家蚕细胞中过表达27-28
• 2.3 目的蛋白过表达对Bm NPV多角体启动子转录调控28-29
• 2.3.1 脂质体介导的过表达载体转染家蚕细胞28-29
• 2.3.2 双萤光素酶活性检测29
• 2.4 39k、lef5、orf61基因缺失型双萤光素酶病毒载体的构建29-32
• 2.4.1 p KD46质粒提取29-30
• 2.4.2 p KD46质粒的转化30
• 2.4.3 含p KD46的DH10Bac感受态的制备30
• 2.4.4 39k、lef5、orf61基因打靶片段的制备30-31
• 2.4.5 39k、lef5、orf61基因缺失型双萤光素酶病毒载体的构建31
• 2.4.6 39k、lef5、orf61基因缺失型双萤光素酶病毒载体的鉴定31-32
• 2.5 39k、lef5、orf61基因缺失对Bm NPV多角体启动子转录调控32-33
• 2.5.1 脂质体介导的敲除型Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc转染家蚕细胞32
• 2.5.2 双萤光素酶活性检测32-33
• 3 结果与分析33-39
• 3.1 重组转移载体p Fast Bac Dual-A3-Rluc-polh-Fluc的PCR鉴定33-34
• 3.2 双萤光素病毒载体wt-Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc的PCR鉴定34
• 3.3 过表达载体的PCR鉴定34-35
• 3.4 目的蛋白过表达的Western blotting分析35-36
• 3.5 目的蛋白过表达对Bm NPV多角体启动子转录调控36-37
• 3.6 39k、lef5、orf61基因缺失型双萤光素酶病毒载体的鉴定37-38
• 3.7 39k、lef5、orf61基因缺失对Bm NPV多角体启动子转录调控38-39
• 4 讨论39-41
• 第四章 家蚕杆状病毒 39k基因功能研究41-61
• 1 材料与试剂41-42
• 1.1 材料41
• 1.2 试剂41
• 1.3 试剂配制41-42
• 2 方法42-49
• 2.1 39k基因的序列分析42
• 2.2 39k基因的转录时相42-43
• 2.2.1 家蚕细胞的复苏及培养42
• 2.2.2 Bm NPV病毒感染Bm N细胞的总RNA的提取42-43
• 2.2.3 c DNA第一链的合成43
• 2.2.4 39k基因的转录时相43
• 2.3 39k基因缺失型和修复型病毒的构建43-45
• 2.3.1 39k基因缺失型Bacmid的构建43-44
• 2.3.2 39k基因修复型Bacmid的构建44-45
• 2.3.2.1 转移载体p Fast Bac- 39k的构建44
• 2.3.2.2 39k基因修复型Bacmid的构建44-45
• 2.4 39k基因缺失对Bm NPV病毒滴度的影响45-46
• 2.4.1 碱裂解法提取重组Bacmid45
• 2.4.2 重组Bacmid转染家蚕细胞45
• 2.4.3 病毒滴度的测定45-46
• 2.5 39k基因缺失对Bm NPV病毒基因组复制情况检测46-48
• 2.5.1 Bm NPV病毒基因组的提取46-47
• 2.5.2 q PCR检测Bm NPV病毒基因组复制情况47
• 2.5.3 q PCR标准曲线的绘制47
• 2.5.4 q PCR检测Bm NPV病毒基因组复制情况47-48
• 2.6 39k基因缺失对Bm NPV基因转录的影响48-49
• 2.6.1 重组Bacmid转染家蚕细胞48
• 2.6.3 Bm NPV病毒感染Bm N细胞的总RNA的提取及c DNA制备48
• 2.6.4 q PCR检测 39k基因缺失对Bm NPV各时期基因转录的影响48-49
• 3 结果与分析49-59
• 3.1 39k基因序列分析49-50
• 3.2 39K蛋白氨基酸同源性比对50-52
• 3.3 39k基因的转录时相52
• 3.4 39k基因缺失型Bacmid的鉴定52-53
• 3.5 39k基因修复型Bacmid的鉴定53-54
• 3.6 39k基因缺失型Bm NPV感染细胞的情况54-55
• 3.7 39k基因缺失对Bm NPV病毒滴度的影响55-56
• 3.8 39k基因缺失对Bm NPV基因组复制的影响56-57
• 3.9 39k基因缺失对Bm NPV基因转录的影响57-59
• 4 讨论59-61
• 结论61-62
• 参考文献62-67
• 附录67-69
• 致谢69

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  本文关键词：家蚕杆状病毒多角体启动子结合蛋白筛选及39k基因功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：345472