Survivin启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用

发布时间：2021-11-28 10:52

　　目的:1.构建一种由survivin启动子介导的重组载体pc DNA3.1-p Survivin-TK。2.检测由survivin启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVtk）自杀基因的真核表达载体pc DNA3.1-p Survivin-TK在肝癌细胞内是否能够特异性表达。3.研究由survivin启动子介导的HSVtk自杀基因联合更昔洛韦（GCV）对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法:1.体外培养HL-7702人正常肝细胞、HEK293T人胚肾细胞、Hep G2及Hu H-7人肝癌细胞。2.提取Hep G2细胞的基因组DNA,PCR扩增survivin启动子序列;构建重组载体pc DNA3.1-p Survivin-TK并进行测序,通过BLAST对DNA序列的同源性进行比对;将该质粒载体转导入大肠杆菌DH5α中,通过菌液PCR扩增HSVtk基因,采用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。3.用重组质粒pc DNA3.1-p Survivin-TK分别转染HL-7702、HEK293T、Hep G2及Hu H-7细胞,48小时后提取细胞总RNA及总蛋白,经RT-PCR法及Western blot法检... 

【文章来源】：山西医科大学山西省

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

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前言
1 实验材料
    1.1 细胞株
    1.2 菌种
    1.3 质粒
    1.4 主要试剂
    1.5 实验所需引物
    1.6 主要仪器及器材
    1.7 主要试剂的配制方法
2 实验方法
    2.1 重组质粒pcDNA3.1-pSurvivin-TK的构建与鉴定
    2.2 细胞培养与转染
    2.3 RT-PCR法
    2.4 Western blot法
    2.5 MTT法
    2.6 Hoechst染色法
    2.7 Annexin V-PI细胞凋亡检测法
    2.8 细胞内活性氧的荧光探针检测法
    2.9 Caspase-3 染色法
    2.10 统计学分析
3 实验结果
    3.1 细胞培养
    3.2 pcDNA3.1-pSurvivin-TK质粒的构建与鉴定
    3.3 RT-PCR法检测HSVtk基因的mRNA表达
    3.4 Western blot法检测HSVtk基因的蛋白表达
    3.5 MTT法检测细胞存活率
    3.6 Hoechst染色法检测细胞凋亡
    3.7 流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化
    3.8 HSVtk/GCV系统对细胞内活性氧水平的影响
    3.9 细胞内活化caspase-3 水平的变化
4 讨论
5 结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
在学期间承担/参与的科研课题与研究成果
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3524288