原位敲除猕猴RHO基因建立非人灵长类视网膜色素变性模型

发布时间：2021-12-19 17:11

　　视觉作为人类最重要的感知觉,承担人类80%以上的外界信息获取。视网膜则是视觉功能的起始器官,其位于眼球底部,含有多种严格分层的神经元和胶质细胞。视网膜中的感光细胞负责把光信号转化为电信号,通过多级神经元,将信号最终传输给大脑中枢。但是,遗传性视网膜退行性疾病由于基因突变或者缺失,导致感光细胞不可逆死亡,剥夺了患者看见光明的机会。视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)便是其中的一大亚类,其致病基因广,基因突变高度异质化,目前治疗手段发展仍十分缓慢。视网膜色素变性是一种较为常见的遗传性视网膜疾病。研究发现患者发病初期由于视杆细胞死亡而出现夜盲症,后期伴随着视锥细胞的逐渐丧失,白天视力下降,最终完全致盲。目前有超过50个基因被鉴定与视网膜色素变性相关。为了研究视网膜色素变性的潜在致病机制并开发相应的治疗方法,研究者已经建立了多个视网膜色素变性啮齿类动物模型,如rd1,rd10,Rho-/-和RhoP23H/+突变小鼠等。这些模型表现出感光细胞和视力的逐渐丧失,部分模拟了人类视网膜色素变性病理特征。然而,啮齿类动物与人类在进化上相距较远,在遗传学水平上和生理学水平上存...

【文章来源】： 中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：99 页

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摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 视网膜结构及功能
        1.1.1 视网膜的组成
        1.1.2 光信号转导通路
    1.2 视网膜色素变性
        1.2.1 视网膜色素变性的临床特征
        1.2.2 视网膜色素变性的致病基因及遗传
        1.2.3 RHO基因的致病机理
    1.3 常用的视网膜色素变性动物模型
        1.3.1 啮齿类动物视网膜色素变性模型
        1.3.2 大动物视网膜色素变性模型
    1.4 CRISPR/Cas9基因编辑工具
    1.5 AAV基因转导载体
    1.6 本课题的选题理由及主要研究内容
        1.6.1 课题背景及选题目的
        1.6.2 课题研究内容
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验动物
        2.1.1 实验动物伦理许可
        2.1.2 实验动物管理
    2.2 常规分子克隆实验
        2.2.1 PCR聚合酶链式反应
        2.2.2 DNA凝胶回收
        2.2.3 限制性内切酶酶切与DNA连接
        2.2.4 T-A克隆
        2.2.5 质粒转化实验
        2.2.6 鉴定目标克隆
        2.2.7 质粒的小量抽提
        2.2.8 质粒的大量抽提
        2.2.9 Q-PCR实验
    2.3 细胞培养与转染
        2.3.1 HEK293T细胞的复苏与培养
        2.3.2 HEK293T细胞的传代
        2.3.3 HEK293T细胞的转染
    2.4 AAV载体构建和病毒制备
        2.4.1 CRISPR/Cas9表达载体构建
        2.4.2 荧光报告基因表达载体构建
        2.4.3 AAV病毒的包装
        2.4.4 AAV病毒的纯化
        2.4.5 AAV病毒滴度的测定
        2.4.6 AAV病毒感染力检测
        2.4.7 透射电子显微镜(TEM)检测AAV
    2.5 DNA、RNA和蛋白质的提取与检测
        2.5.1 基因组DNA的提取
        2.5.2 SaCas9敲除效率检测
        2.5.3 TRlzol提取RNA
        2.5.4 逆转录PCR (RT-PCR)
        2.5.5 蛋白质的提取
        2.5.6 Western blot
        2.5.7 De novo Sequence
    2.6 冷冻切片、免疫组化和显微成像
        2.6.1 视网膜冷冻切片
        2.6.2 免疫组化染色
    2.7 视网膜下腔注射
        2.7.1 猕猴视网膜下腔注射
        2.7.2 小鼠视网膜下腔注射
    2.8 猕猴视网膜临床检查
        2.8.1 眼底成像与荧光造影成像
        2.8.2 OCT成像
    2.9 透射电子显微镜(TEM)成像
    2.10 离体视网膜电图(ex vivo ERG)记录
        2.10.1 离体ERG
        2.10.2 ERG a-wave的分离
    2.11 统计分析
第3章 实验结果与结论
    3.1 CRISPR/SaCas9敲除猕猴RHO的分子设计
    3.2 AAV-CRISPR/SaCas9系统有效性检验
        3.2.1 hSyn启动子在HEK293T和感光细胞中有效表达检验
        3.2.2 视网膜下腔注射ShH10 AAV血清型特异感染感光细胞
        3.2.3 体外检验CRISPR/SaCas9系统有效性
    3.3 在体AAV-CRISPR/SaCas9系统有效敲除猕猴感光细胞RHO
        3.3.1 在体敲除猕猴视网膜RHO实验设计
        3.3.2 猕猴感光细胞RHO被有效敲除
        3.3.3 Cas9-RHO视网膜RHO蛋白表达显著降低
    3.4 敲除RHO的猕猴视网膜产生类似RP的感光细胞退化
        3.4.1 Cas9-RHO视网膜视杆细胞发生退化
        3.4.2 Cas9-RHO视网膜视锥细胞发生退化
        3.4.3 Cas9-RHO视网膜进行性退化
        3.4.4 Cas9-RHO视网膜发生胶质细胞活化
    3.5 Cas9-RHO视网膜显示出与RP一致的临床特征
        3.5.1 Cas9-RHO视网膜存在血管病变
        3.5.2 Cas9-RHO视网膜表现明显的外核层变薄
        3.5.3 OCT显示Cas9-RHO视网膜进行性退化
    3.6 Cas9-RHO视网膜中视杆细胞亚细胞结构退化
    3.7 Cas9-RHO视网膜的视网膜生理功能受损
        3.7.1 ex vivo ERG记录与a-wave的分离
        3.7.2 Cas9-RHO视网膜感光细胞光反应降低
第4章 总结与讨论
    4.1 工作总结
    4.2 工作创新性及其应用
        4.2.1 本研究意义和创新性
        4.2.2 本研究应用
    4.3 工作局限及未来方向
        4.3.1 基于生殖细胞基因编辑的非人灵长类RP模型仍是必要的
        4.3.2 更高效的在体基因编辑效率
        4.3.3 机械损伤与病理发生相分离
        4.3.4 在体基因编辑效率的确定
        4.3.5 在体基因编辑的拓展
参考文献
附录A 实验仪器设备
附录B 主要试剂
附录C 主要溶液配制
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果



本文编号：3544745