利用CRISPR/Cas9技术建立诱导性敲除MEIS1基因的HEK293T细胞株

发布时间：2021-12-25 01:37

　　CRISPR/Cas9是新一代基因组编辑技术,可简便快捷地在哺乳动物细胞对基因进行敲除、敲入。但常规的CRISPR/Cas9表达系统直接转染效果差、病毒包装效率低,极大地限制了CRISPR/Cas9系统的广泛使用。该研究应用Tet-on系统,建立了Dox诱导Cas9表达的293T细胞株,命名为293T-i Cas9。MEIS1（myeloid ectropic viral integration site 1）是TALE（three amino acid loop extension）同源域家族的转录因子,其在白血病发生发展、胚胎造血系统发育及神经系统发育中有重要作用,但其作用机制仍未完全明确。将靶向MEIS1 Exon3的sg MEIS1表达载体转入293T-iCas9,SURVEYOR实验和Western blot检测结果表明,sg MEIS1有效地指导Cas9进行基因组编辑。最终经测序和Western blot结果证明,成功建立了MEIS1敲除细胞株,这为研究MEIS1的功能提供了重要的工具。 

【文章来源】：中国细胞生物学学报. 2016,38(08)CSCD

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 细胞株和质粒
        1.1.2 试剂及仪器
    1.2 实验方法
        1.2.1 sg RNA设计与sg RNA表达载体构建
        1.2.2 细胞培养
        1.2.3 病毒包装、感染及转染
        1.2.4 基因组DNA提取
        1.2.5 SURVEYOR检测突变效率
        1.2.6 蛋白免疫印迹(Western blot)
        1.2.6 流式细胞术
        1.2.7 测序及序列分析
        1.2.8 脱靶效应验证
2 结果
    2.1 构建Dox诱导表达Cas9的慢病毒载体
    2.2 建立Dox诱导表达Cas9的293T-i Cas9细胞株
    2.3 鉴定sg MEIS1表达载体对MEIS1基因组编辑的功能
    2.4 利用Dox诱导表达Cas9的方法建立MEIS1基因敲除的293T细胞株
3 讨论



本文编号：3551558