转vp28基因蓝藻抗WSSV重组疫苗的稳定性和安全性
发布时间：2022-01-01 01:30
白斑综合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）是一种引起对虾爆发性死亡的病毒,因其传播速度快、宿主范围广、致死率高等特点,已成为对虾养殖业严重病害之一。目前全球已研制出多种药物,如各种重组疫苗（DNA疫苗、RNA疫苗和蛋白亚单位疫苗）等,在实验室水平均有成效。然而,至今尚未见可在养殖业规模应用。我们研究集体已根据WSSV主要囊膜蛋白VP28在防治WSSV中的重要作用,用蓝藻这一原核表达系统表达VP28蛋白,经实验验证可有效免疫对虾虾苗。基于我们研究集体十几年来的研究进展,本学位研究着重关注这种重组疫苗产业化过程中产品的稳定性和安全性,得到以下主要结果:（1）针对本疫苗在中试生产中发生目的基因丢失的情况,对重组载体质粒（携带目的基因）的稳定性作了分析。关键重组载体质粒pRL-489-vp28和pGM-T-WSSV-vp28在转化大肠杆菌TOP10后,通过不同抗生素压力筛选得到保持良好稳定性条件。发现前者超过10 h,后者超过7 h后,质粒损失率均迅速大于10%。培养10-16个小时后,转化大肠杆菌菌液OD600值可达1.2-2.8之间,有效细菌平均却只在6...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
WSSV(中国大陆株)基因组基本结构
上海海洋大学硕士学位论文一个月，重组疫苗样品便开始发黄、出现白色霉菌并有腥臭味(图 3-1 C)；在 4 ℃低温冰箱中存放的样品虽然放置 5 个月时还没有发出异味，但是会在四个月左右出现白色霉菌(图 3-1 B)，且边缘有蓝色液体渗出(图 3-1 D)，疑似为藻粉中藻蓝蛋白从细胞里渗出。-80℃和-20℃条件下储存的样品变化差异不明显，样品表面仍为绿色的藻体本身颜色(图 3-1 A)，但是否两者之间有具体的变化、差异，需进行更为细致的分子检测和生物学活性检测。
图 3-3 RT-qPCR 检测标准曲线Fig.3-3 RT-qPCR detection standard curve预实验发现，由于重组疫苗本身的蛋白质特性，样品在 4℃处理条件下连月取样中，超过2个月即无法提取完整RNA作为RT-qPCR检测样本模板得到其检测结果。同理，30℃储存的样品在一个月以上时就开始发黄产生甚至变黏使其无法提取 RNA。因此在后续检测中，连续三批重组疫苗取第 1-3 批样品中，-80℃取样均为储存 6 个月的样品（简记为 A1、A2、A3），取样均为储存 6 个月的样品（简记为 B1、B2、B3），4℃取样均为储存 样品（简记为 C1、C2、C3），30℃取样均为储存 1 个月的样品（简记为D2、D3）。 3-5 是连续三批重组疫苗在不同储存温度下的 RT-qPCR 实验结果，图 3-电泳图（引物大小 184bp）。综合图 3-4 和表 3-5 实验结果可以看出，样品℃储存 6 个月后仍具有良好的基因表达率，即 vp28 基因没有丢失。-20℃、 30℃中储存重组疫苗，即使储存时间短，也有部分样品中 vp28 基因丢失。The logarithm of the copy numberM A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3
【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞样Western Blot分析技术探讨[J]. 汤加勇,赵华. 实验科学与技术. 2017(06)
[2]莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因叶绿体表达及其对油脂蛋白质含量的影响[J]. 冯思豫,施定基,贾晓会,朱嘉诚,米华玲,贾睿,何培民. 上海海洋大学学报. 2017(05)
[3]冻融法和超声破碎法提取螺旋藻中藻蓝蛋白的工艺研究[J]. 侯兆乾,刘鑫阳,史超,段开红,田瑞华. 内蒙古农业大学学报(自然科学版). 2017(02)
[4]转vp28蓝藻口服剂对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力及免疫反应的影响[J]. 郭媛媛,殷嵘,施定基,周园,何培民,吴倩萍,庄旻敏,韦章良,贾睿. 水产学报. 2017(09)
[5]人类寄生虫重组疫苗研究进展[J]. 张忠佩,秦元华,任一鑫,余钢银,戴晓冬,郑莉莉,张雪强,崔昱. 中国病原生物学杂志. 2017(05)
[6]不同途径感染白斑综合征病毒（WSSV）对日本沼虾的致病性[J]. 殷嵘,郭媛媛,韦章良,施定基,何培民,贾睿. 生物工程学报. 2017(06)
[7]白斑综合征病毒（WSSV）基因VP28原核表达与检测[J]. 张正阳,张春莉,施定基,贾晓会,贾睿,何培民. 上海海洋大学学报. 2017(02)
[8]VP28-CecropinD融合蛋白抗对虾白斑综合征病毒效果的研究[J]. 王诗怡,夏晨阳,怀浩,胡捷,孟明翔. 科技展望. 2016(36)
[9]原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN的构建及鉴定[J]. 喻备,黄媛,胡海峰,汪自力,杨进. 现代肿瘤医学. 2017(04)
[10]反复冻融法对枸杞多糖溶出率的研究[J]. 温梓辰,荣雪,郭乃菲,陈点点,王慧妍,胡丹,刘广斌. 安徽农业科学. 2016(19)
博士论文
[1]肿瘤治疗型抗体药物的研发[D]. 唐喆伟.华东师范大学 2013
[2]对虾白斑综合症病毒（WSSV）膜蛋白VP12和VP150的功能研究以及病毒极早期基因RNA干扰的初步研究[D]. 李建波.厦门大学 2013
[3]乙型脑炎病毒分子流行病学、诊断及重组疫苗研究[D]. 刘昊.吉林大学 2013
[4]鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究[D]. 刘存霞.吉林大学 2013
[5]栉孔扇贝（Chlamys farreri）组织凝集活性分析及一种C-型凝集素单克隆抗体的研制和特性研究[D]. 谈艳苗.中国海洋大学 2013
[6]蛋白质组学和代谢组学技术筛选颅脑损伤促进骨折愈合的关键分子[D]. 杨树广.中国人民解放军军事医学科学院 2012
[7]抗WSSV口服VP28亚单位疫苗研究及促克氏螯虾生长口服DNA药物研究[D]. 张毅.武汉大学 2011
[8]中国对虾“黄海2号”对WSSV的抗病性分析[D]. 孟宪红.中国海洋大学 2010
[9]水稻谷蛋白的质谱和Western Blot鉴定与贮藏蛋白分析[D]. 何莹.武汉大学 2010
[10]转基因作物生物安全性评价与监管体系的分析与对策[D]. 王琴芳.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]低磷胁迫大豆RT-qPCR内参基因的筛选及谷胱丙肽合成代谢酶的表达[D]. 陈玉连.广西大学 2017
[2]vp28基因在集胞藻中的克隆表达及转基因工程藻的纯化[D]. 朱嘉诚.上海海洋大学 2017
[3]基于高丰度转录本的细菌RT-qPCR检测技术及其应用[D]. 王新辉.吉林大学 2016
[4]对虾白斑综合症病毒（WSSV）基因原核表达与检测[D]. 张正阳.上海海洋大学 2016
[5]九种杀藻剂和三种复配杀藻剂对铜绿微囊藻、小球藻和水绵生长的影响[D]. 高伟.河南师范大学 2016
[6]对虾WSSV和IHHNV病毒重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法的研究[D]. 夏小明.上海海洋大学 2015
[7]广西凡纳滨对虾白斑综合征病毒的检测及结构蛋白VP24和VP51的克隆与表达[D]. 彭亚.广西大学 2015
[8]肉食动物细小病毒重组疫苗研究[D]. 杨洋.吉林大学 2013
[9]中国大陆几株WSSV毒株毒力测定及分析[D]. 刘飞.中国海洋大学 2013
[10]对虾白斑综合征病毒（WSSV）VP12、VP14、VP51、VP136C与病毒及宿主蛋白的相互作用[D]. 马方方.上海海洋大学 2013
本文编号：3561386
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
WSSV(中国大陆株)基因组基本结构
上海海洋大学硕士学位论文一个月，重组疫苗样品便开始发黄、出现白色霉菌并有腥臭味(图 3-1 C)；在 4 ℃低温冰箱中存放的样品虽然放置 5 个月时还没有发出异味，但是会在四个月左右出现白色霉菌(图 3-1 B)，且边缘有蓝色液体渗出(图 3-1 D)，疑似为藻粉中藻蓝蛋白从细胞里渗出。-80℃和-20℃条件下储存的样品变化差异不明显，样品表面仍为绿色的藻体本身颜色(图 3-1 A)，但是否两者之间有具体的变化、差异，需进行更为细致的分子检测和生物学活性检测。
图 3-3 RT-qPCR 检测标准曲线Fig.3-3 RT-qPCR detection standard curve预实验发现，由于重组疫苗本身的蛋白质特性，样品在 4℃处理条件下连月取样中，超过2个月即无法提取完整RNA作为RT-qPCR检测样本模板得到其检测结果。同理，30℃储存的样品在一个月以上时就开始发黄产生甚至变黏使其无法提取 RNA。因此在后续检测中，连续三批重组疫苗取第 1-3 批样品中，-80℃取样均为储存 6 个月的样品（简记为 A1、A2、A3），取样均为储存 6 个月的样品（简记为 B1、B2、B3），4℃取样均为储存 样品（简记为 C1、C2、C3），30℃取样均为储存 1 个月的样品（简记为D2、D3）。 3-5 是连续三批重组疫苗在不同储存温度下的 RT-qPCR 实验结果，图 3-电泳图（引物大小 184bp）。综合图 3-4 和表 3-5 实验结果可以看出，样品℃储存 6 个月后仍具有良好的基因表达率，即 vp28 基因没有丢失。-20℃、 30℃中储存重组疫苗，即使储存时间短，也有部分样品中 vp28 基因丢失。The logarithm of the copy numberM A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3
【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞样Western Blot分析技术探讨[J]. 汤加勇,赵华. 实验科学与技术. 2017(06)
[2]莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因叶绿体表达及其对油脂蛋白质含量的影响[J]. 冯思豫,施定基,贾晓会,朱嘉诚,米华玲,贾睿,何培民. 上海海洋大学学报. 2017(05)
[3]冻融法和超声破碎法提取螺旋藻中藻蓝蛋白的工艺研究[J]. 侯兆乾,刘鑫阳,史超,段开红,田瑞华. 内蒙古农业大学学报(自然科学版). 2017(02)
[4]转vp28蓝藻口服剂对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力及免疫反应的影响[J]. 郭媛媛,殷嵘,施定基,周园,何培民,吴倩萍,庄旻敏,韦章良,贾睿. 水产学报. 2017(09)
[5]人类寄生虫重组疫苗研究进展[J]. 张忠佩,秦元华,任一鑫,余钢银,戴晓冬,郑莉莉,张雪强,崔昱. 中国病原生物学杂志. 2017(05)
[6]不同途径感染白斑综合征病毒（WSSV）对日本沼虾的致病性[J]. 殷嵘,郭媛媛,韦章良,施定基,何培民,贾睿. 生物工程学报. 2017(06)
[7]白斑综合征病毒（WSSV）基因VP28原核表达与检测[J]. 张正阳,张春莉,施定基,贾晓会,贾睿,何培民. 上海海洋大学学报. 2017(02)
[8]VP28-CecropinD融合蛋白抗对虾白斑综合征病毒效果的研究[J]. 王诗怡,夏晨阳,怀浩,胡捷,孟明翔. 科技展望. 2016(36)
[9]原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN的构建及鉴定[J]. 喻备,黄媛,胡海峰,汪自力,杨进. 现代肿瘤医学. 2017(04)
[10]反复冻融法对枸杞多糖溶出率的研究[J]. 温梓辰,荣雪,郭乃菲,陈点点,王慧妍,胡丹,刘广斌. 安徽农业科学. 2016(19)
博士论文
[1]肿瘤治疗型抗体药物的研发[D]. 唐喆伟.华东师范大学 2013
[2]对虾白斑综合症病毒（WSSV）膜蛋白VP12和VP150的功能研究以及病毒极早期基因RNA干扰的初步研究[D]. 李建波.厦门大学 2013
[3]乙型脑炎病毒分子流行病学、诊断及重组疫苗研究[D]. 刘昊.吉林大学 2013
[4]鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究[D]. 刘存霞.吉林大学 2013
[5]栉孔扇贝（Chlamys farreri）组织凝集活性分析及一种C-型凝集素单克隆抗体的研制和特性研究[D]. 谈艳苗.中国海洋大学 2013
[6]蛋白质组学和代谢组学技术筛选颅脑损伤促进骨折愈合的关键分子[D]. 杨树广.中国人民解放军军事医学科学院 2012
[7]抗WSSV口服VP28亚单位疫苗研究及促克氏螯虾生长口服DNA药物研究[D]. 张毅.武汉大学 2011
[8]中国对虾“黄海2号”对WSSV的抗病性分析[D]. 孟宪红.中国海洋大学 2010
[9]水稻谷蛋白的质谱和Western Blot鉴定与贮藏蛋白分析[D]. 何莹.武汉大学 2010
[10]转基因作物生物安全性评价与监管体系的分析与对策[D]. 王琴芳.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]低磷胁迫大豆RT-qPCR内参基因的筛选及谷胱丙肽合成代谢酶的表达[D]. 陈玉连.广西大学 2017
[2]vp28基因在集胞藻中的克隆表达及转基因工程藻的纯化[D]. 朱嘉诚.上海海洋大学 2017
[3]基于高丰度转录本的细菌RT-qPCR检测技术及其应用[D]. 王新辉.吉林大学 2016
[4]对虾白斑综合症病毒（WSSV）基因原核表达与检测[D]. 张正阳.上海海洋大学 2016
[5]九种杀藻剂和三种复配杀藻剂对铜绿微囊藻、小球藻和水绵生长的影响[D]. 高伟.河南师范大学 2016
[6]对虾WSSV和IHHNV病毒重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法的研究[D]. 夏小明.上海海洋大学 2015
[7]广西凡纳滨对虾白斑综合征病毒的检测及结构蛋白VP24和VP51的克隆与表达[D]. 彭亚.广西大学 2015
[8]肉食动物细小病毒重组疫苗研究[D]. 杨洋.吉林大学 2013
[9]中国大陆几株WSSV毒株毒力测定及分析[D]. 刘飞.中国海洋大学 2013
[10]对虾白斑综合征病毒（WSSV）VP12、VP14、VP51、VP136C与病毒及宿主蛋白的相互作用[D]. 马方方.上海海洋大学 2013
本文编号：3561386
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3561386.html
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