热纤梭菌嗜热阿魏酸酯酶基因在植物中的异源表达研究
发布时间：2022-01-05 22:54
木质纤维素是生物质能源的重要表现形式,具有储量丰富,可持续再生,环境友好等特点。植物细胞壁坚固的抗降解屏障是限制木质纤维素高效转化利用的关键因子。阿魏酸是半纤维素分子之间以及半纤维素与木质素分子之间共价交联的桥梁,在植物细胞壁复杂的高分子网络结构形成中起关键作用,从而阻碍降解酶对细胞壁的降解。微生物源的阿魏酸酯酶基因在植物中的表达可以有效提高细胞壁的降解转化效率,但常温酶在植物生长发育过程中表达酶活性,对宿主细胞生长发育有干扰和毒害作用。本文采用热纤梭菌来源的嗜热阿魏酸酯酶基因进行遗传转化,实现植物生长发育安全和细胞壁易降解转化的双重目标,其主要研究成果如下:1)为提高FAE酶在植物细胞内的表达效率,首先优化了该基因的密码子,替换稀有密码子,提高GC%等。分别构建了该嗜热FAE基因在细胞质、质外体、内质网、叶绿体和线粒体中定位表达的一系列重组基因植物表达载体pBINPLUS-ImpactVectors-FAEx。2)通过农杆菌介导的方法遗传转化拟南芥,采用PCR的方法筛选鉴定转基因拟南芥植株,成功筛选到FAE1（胞质表达）、FAE2（质外体表达）、FAE4（叶绿体表达）和FAE5（线粒...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
禾本科植物细胞壁结构
江苏大学硕士学位论文7图1.2 禾本科植物细胞壁半纤维素的分子结构Fig. 1.2 Molecular structure of hemicellulose in the cell wall of gramineous plants改绘自Wong (2005)FA,阿魏酸;Xyl,木糖,Ara,阿拉伯糖;AX,阿拉伯木聚糖;GAX,阿拉伯糖葡糖醛酸木聚糖;GlcA,葡糖醛酸;Lignin,木质素. 箭头所示位置为阿魏酸酯酶的水解位点.1.3 木质纤维素降解酶基因在植物细胞中的异源表达细胞壁降解，是将各种细胞壁组分分解成较小的组成单元。细胞壁降解需要几个步骤：去除或分解木质素和其他可能抑制酶促反应并阻止纤维素酶进入纤维素的物质；去除或水解半纤维素以使纤维素暴露于纤维素酶；纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖。据报道，外源木质纤维素降解酶基因在植物细胞中高效表达可以提高生物质转化效率，可以为能源植物、牧草和农作物秸秆的高效资源化利用提供新的思路。近年来，越来越多科研人员将外源的木质纤维素降解酶在植物细胞中异源表达，利用这些植物作为生物反应器，使木质纤维素酶在植物生长过程中大量表达并在细胞内积累。收获后将生物质粉碎、预处理，再进一步利用自身表达的酶发酵，减少添加外源木质纤维素酶，以提高植物降解效率，进一步用于发酵生产乙醇
占碱基总数的26.60%，密码子改变262个，占密码子总数66.16%（图2.4）。2.3.2 植物高效表达载体的构建琼脂糖凝胶电泳（图2.5）显示，经限制性内切酶NocI及NotI的双酶切，PUC57-FAE1克隆载体有两条大小不同的DNA片段，其中FAE基因长1188bp。图2.5 嗜热阿魏酸酯酶FAE基因序列的酶切结果Fig. 2.5 Thedigestion results of the FAEsequences from C. thermocellum为了进一步提高嗜热FAE酶在植物体内的表达效率，我们在优化基因的基础上，分别构建了该嗜热FAE酶在胞质、质外体、内质网、叶绿体和线粒体中定位表达的重组基因植物表达载体。将优化后人工合成的嗜热FAE基因经过NotI和NcoI双酶切与ImpactVector载体的不同信号肽编码序列融合，构建了在植物不同亚细胞空间表达的ImpactVectors-FAE系列载体，以将嗜热FAE蛋白靶向细胞质，质外体，内质网，叶绿体和线粒体。再进一步将构建好的重组基因序列经过PacI和AscI双酶切插入到植物高效表达载体pBINPLUS中
【参考文献】：
期刊论文
[1]嗜热内切葡聚糖酶（E1）植物亚细胞定位表达载体的构建及验证[J]. 李齐东,高璐,蒋建雄,武艳芳,李霞,王永丽,刘瑶瑶,孙建中. 江苏农业学报. 2018(06)
[2]我国秸秆分布情况及转化生产燃料乙醇的研究进展[J]. 余建明,施凯强,王盛炜,许召贤,翟睿,闻志强,金明杰. 生物产业技术. 2018(04)
[3]国内燃料乙醇的发展现状及展望[J]. 王佳臻,赵广,郭旭青. 山西化工. 2017(05)
[4]《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》印发[J]. 本刊编辑部. 中国能源. 2017(09)
[5]世界燃料乙醇发展现状分析[J]. 米多,陈金,狄焕亮. 化学工业. 2017(04)
[6]生物转化能源草制取纤维素乙醇的研究进展[J]. 白龙,李春美,吕途,杜颖,杨玥,田沈. 生物技术通报. 2017(05)
[7]纤维素乙醇生产技术及产业化进展[J]. 张俊苗. 纸和造纸. 2017(03)
[8]纤维素乙醇的生产工艺及其应用前景[J]. 彭静静. 江苏农业科学. 2017(07)
[9]嗜热细菌Clostridium thermocellum阿魏酸酯酶基因的克隆、异源表达及酶学特性分析[J]. 刘奕彤,孙建中,蒋建雄. 微生物学通报. 2017(06)
[10]纤维素乙醇生产工艺研究进展[J]. 阮文彬,丁长河,张玲. 粮食与油脂. 2015(11)
博士论文
[1]基于木质纤维素能源作物预处理及发酵转化乙醇的过程强化[D]. 张敬芝.北京化工大学 2017
[2]芒属植物组织培养及南荻胚性愈伤组织形成基因研究[D]. 赵玲玲.武汉大学 2016
[3]能源植物芒草细胞壁结构组成与糖化发酵关系的研究[D]. 佀胜利.华中农业大学 2015
[4]植物细胞壁结构特征与生物质高效利用分子机理研究[D]. 李丰成.华中农业大学 2015
[5]耐高温纤维水解酶的研究[D]. 时号.南京林业大学 2013
硕士论文
[1]芒草细胞壁降解中的多糖变化和NcPMO-2在植物中功能探索[D]. 李榆杨.华中农业大学 2017
[2]能源草生产纤维素乙醇的比较研究[D]. 朱桂英.北京化工大学 2017
[3]干法生物炼制技术生产高浓度纤维素乙醇的同步糖化与共发酵研究[D]. 张强.华东理工大学 2017
[4]热纤梭菌耐热酯酶的表达鉴定及枯草杆菌芽孢表面展示[D]. 张天喜.江苏大学 2016
[5]不同预处理工艺生产纤维素乙醇的技术经济分析[D]. 王丽.大连理工大学 2015
[6]阿魏酸酯酶A的基因克隆、表达及应用研究[D]. 龚燕燕.江南大学 2013
[7]解纤维素热酸菌纤维素酶在植物中的表达[D]. 周晓娅.大连理工大学 2013
[8]芒（Miscanthus sinensis）的农杆菌遗传转化技术体系的构建研究[D]. 周娜.湖南农业大学 2013
[9]芒草细胞壁结构与纤维乙醇产率关系的研究[D]. 淑芬.华中农业大学 2011
[10]极端嗜热天冬氨酸激酶在大肠杆菌中克隆表达、纯化及酶学性质研究[D]. 李敬坡.苏州大学 2008
本文编号：3571196
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
禾本科植物细胞壁结构
江苏大学硕士学位论文7图1.2 禾本科植物细胞壁半纤维素的分子结构Fig. 1.2 Molecular structure of hemicellulose in the cell wall of gramineous plants改绘自Wong (2005)FA,阿魏酸;Xyl,木糖,Ara,阿拉伯糖;AX,阿拉伯木聚糖;GAX,阿拉伯糖葡糖醛酸木聚糖;GlcA,葡糖醛酸;Lignin,木质素. 箭头所示位置为阿魏酸酯酶的水解位点.1.3 木质纤维素降解酶基因在植物细胞中的异源表达细胞壁降解，是将各种细胞壁组分分解成较小的组成单元。细胞壁降解需要几个步骤：去除或分解木质素和其他可能抑制酶促反应并阻止纤维素酶进入纤维素的物质；去除或水解半纤维素以使纤维素暴露于纤维素酶；纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖。据报道，外源木质纤维素降解酶基因在植物细胞中高效表达可以提高生物质转化效率，可以为能源植物、牧草和农作物秸秆的高效资源化利用提供新的思路。近年来，越来越多科研人员将外源的木质纤维素降解酶在植物细胞中异源表达，利用这些植物作为生物反应器，使木质纤维素酶在植物生长过程中大量表达并在细胞内积累。收获后将生物质粉碎、预处理，再进一步利用自身表达的酶发酵，减少添加外源木质纤维素酶，以提高植物降解效率，进一步用于发酵生产乙醇
占碱基总数的26.60%，密码子改变262个，占密码子总数66.16%（图2.4）。2.3.2 植物高效表达载体的构建琼脂糖凝胶电泳（图2.5）显示，经限制性内切酶NocI及NotI的双酶切，PUC57-FAE1克隆载体有两条大小不同的DNA片段，其中FAE基因长1188bp。图2.5 嗜热阿魏酸酯酶FAE基因序列的酶切结果Fig. 2.5 Thedigestion results of the FAEsequences from C. thermocellum为了进一步提高嗜热FAE酶在植物体内的表达效率，我们在优化基因的基础上，分别构建了该嗜热FAE酶在胞质、质外体、内质网、叶绿体和线粒体中定位表达的重组基因植物表达载体。将优化后人工合成的嗜热FAE基因经过NotI和NcoI双酶切与ImpactVector载体的不同信号肽编码序列融合，构建了在植物不同亚细胞空间表达的ImpactVectors-FAE系列载体，以将嗜热FAE蛋白靶向细胞质，质外体，内质网，叶绿体和线粒体。再进一步将构建好的重组基因序列经过PacI和AscI双酶切插入到植物高效表达载体pBINPLUS中
【参考文献】：
期刊论文
[1]嗜热内切葡聚糖酶（E1）植物亚细胞定位表达载体的构建及验证[J]. 李齐东,高璐,蒋建雄,武艳芳,李霞,王永丽,刘瑶瑶,孙建中. 江苏农业学报. 2018(06)
[2]我国秸秆分布情况及转化生产燃料乙醇的研究进展[J]. 余建明,施凯强,王盛炜,许召贤,翟睿,闻志强,金明杰. 生物产业技术. 2018(04)
[3]国内燃料乙醇的发展现状及展望[J]. 王佳臻,赵广,郭旭青. 山西化工. 2017(05)
[4]《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》印发[J]. 本刊编辑部. 中国能源. 2017(09)
[5]世界燃料乙醇发展现状分析[J]. 米多,陈金,狄焕亮. 化学工业. 2017(04)
[6]生物转化能源草制取纤维素乙醇的研究进展[J]. 白龙,李春美,吕途,杜颖,杨玥,田沈. 生物技术通报. 2017(05)
[7]纤维素乙醇生产技术及产业化进展[J]. 张俊苗. 纸和造纸. 2017(03)
[8]纤维素乙醇的生产工艺及其应用前景[J]. 彭静静. 江苏农业科学. 2017(07)
[9]嗜热细菌Clostridium thermocellum阿魏酸酯酶基因的克隆、异源表达及酶学特性分析[J]. 刘奕彤,孙建中,蒋建雄. 微生物学通报. 2017(06)
[10]纤维素乙醇生产工艺研究进展[J]. 阮文彬,丁长河,张玲. 粮食与油脂. 2015(11)
博士论文
[1]基于木质纤维素能源作物预处理及发酵转化乙醇的过程强化[D]. 张敬芝.北京化工大学 2017
[2]芒属植物组织培养及南荻胚性愈伤组织形成基因研究[D]. 赵玲玲.武汉大学 2016
[3]能源植物芒草细胞壁结构组成与糖化发酵关系的研究[D]. 佀胜利.华中农业大学 2015
[4]植物细胞壁结构特征与生物质高效利用分子机理研究[D]. 李丰成.华中农业大学 2015
[5]耐高温纤维水解酶的研究[D]. 时号.南京林业大学 2013
硕士论文
[1]芒草细胞壁降解中的多糖变化和NcPMO-2在植物中功能探索[D]. 李榆杨.华中农业大学 2017
[2]能源草生产纤维素乙醇的比较研究[D]. 朱桂英.北京化工大学 2017
[3]干法生物炼制技术生产高浓度纤维素乙醇的同步糖化与共发酵研究[D]. 张强.华东理工大学 2017
[4]热纤梭菌耐热酯酶的表达鉴定及枯草杆菌芽孢表面展示[D]. 张天喜.江苏大学 2016
[5]不同预处理工艺生产纤维素乙醇的技术经济分析[D]. 王丽.大连理工大学 2015
[6]阿魏酸酯酶A的基因克隆、表达及应用研究[D]. 龚燕燕.江南大学 2013
[7]解纤维素热酸菌纤维素酶在植物中的表达[D]. 周晓娅.大连理工大学 2013
[8]芒（Miscanthus sinensis）的农杆菌遗传转化技术体系的构建研究[D]. 周娜.湖南农业大学 2013
[9]芒草细胞壁结构与纤维乙醇产率关系的研究[D]. 淑芬.华中农业大学 2011
[10]极端嗜热天冬氨酸激酶在大肠杆菌中克隆表达、纯化及酶学性质研究[D]. 李敬坡.苏州大学 2008
本文编号：3571196
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