过表达分泌型植物金属硫蛋白增强转基因烟草富集重金属的机理和抗性
发布时间：2022-01-07 06:12
本实验室先前的研究表明,利用酿酒酵母MF-α信号肽和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）及人源金属硫蛋白（MT3）编码序列构建融合基因,在转基因植物中表达重组蛋白MF-α-EGFP-MT3,MF-α可介导EGFP-MT3分泌到植物体外,增加转基因植物对部分重金属的抗性。植物和动物的金属硫蛋白结构不同,水稻拥有庞大的金属硫蛋白基因家族（编码11种金属硫蛋白,OsMTs）,海篷子（Salicornia europaea L.）有耐盐碱、耐金属的超强能力,因此本研究论文尝试利用MF-α的介导作用在转基因植物中过量表达分泌型水稻金属硫蛋白基因OsMT-I-2b和海篷子金属硫蛋白基因SbMT-2。为了便于表达蛋白的检测,将这两个蛋白基因的编码区与报告基因EGFP融合表达,通过生物公司合成SbMT2和OsMT2与EGFP融合基因序列:EGFP-SbMT2和EGFP-OsMT2,利用Gateway技术构建两个含有α因子信号肽（MF-α）的植物表达载体pK-MF-α-EGFP-SbMT2和pK-MF-α-EGFP-OsMT2,转化烟草和天竺葵,获得相应的转基因株系,考察转基因株系对重金属的富集能力和抗性,进...
【文章来源】：昆明理工大学云南省
【文章页数】：110 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pUC57-SbMT2载体图谱
昆明理工大学硕士学位论文28图2.2Cd2+标准曲线Fig.2.2Cd2+standardcurve2.1.10.2烟草植株各部分镉含量测定溶液中Cd2+的检测：吸取100μL处理液与100μLB-R溶液混合（1：1）。叶表面：将叶片平铺与培养皿中，每个培养皿中加入10mLB-R溶液，为放置溶液挥发使用保鲜膜封闭，每隔1～2min将叶片翻转，保证叶片表面的Cd2+析出，10min后收集溶液，洗涤叶片之前，将叶片放于A4纸上画出轮廓，剪下，称量其重量，剪一张已知面积的A4纸，通过比例间接计算叶片的表面积，计算单位面积的Cd2+含量。根、茎、叶：去离子水清洗表面吸干水分，液氮研磨滴加1mLB-R溶液抽提，震荡离心，收集上清液。2.1.11植物样品中MF-α-EGFP-SbMT2/OsMT2蛋白的测定2.1.11.1EGFP蛋白标准曲线的测定实验室，蛋白表达的测定常用WesternBlot分析技术，但这一方法存在一些弊端，比如操作较为繁琐，需要染色、脱色转膜等，而且在检测过程中蛋白需求量有较高要求。有人运用电化学免疫方法来分析蛋白，如制备甲胎蛋白免疫传感器，在肿瘤标志物的测定等方向研究较广[126]，此方法检测速度较快、灵敏度较高。参考李胜昔[127]等人的方法，采用物理组装将EGFP兔抗（捕获探针）吸附在印刷电极表面，随后将待检测物即待检测的蛋白物理吸附在其表面，然后连接信号探针（将EGFP兔抗采用特异性结合的方法进行生物素标记），SA-HRP（辣根过氧化物酶标记链霉亲和素）会和生物素亲和连接，在印刷电极表面结合，使
昆明理工大学硕士学位论文29用电化学工作站检测，辣根过氧化物酶催化底物的氧化还原电流得以检测。实验原理见图3.4。图2.3丝网印刷电极检测蛋白含量原理示意图Fig.2.3schematicdiagramofscreenprintingelectrodedetectionproteincontentSchematicdiagramofscreenprintedelectrodedetectionprotein生物素标记EGFP兔抗的获得（1）标记方法a.将5mgBiotion-XX-NHS溶解在250μLDMF中；b.将EGFP兔抗蛋白溶解在0.01mol/L的磷酸缓冲液（PBS）中；c.Biotin与EGFP兔抗蛋白按照1:1体积比例混合（由于需要标记的EGFP兔抗100μL，故此处的Biotin与EGFP抗体蛋白分别为60μL，以免在过凝胶柱的时候量不足，影响实验结果），并且在室温下超声震荡1h；d.反应液过凝胶柱，以0.01mol/LpH=7.4的磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白部分，为不含游离Biotin的结合物。（2）凝胶柱的使用凝胶柱大约有3mL的凝胶体积，凝胶的量限制了可被纯化的空间，所以，最多100μL的蛋白液加至柱床。a.首先，为使凝胶沉积（驱除气泡），需要加入一定体积的磷酸缓冲液（PBS），一般与柱床体积的量一致，如2mL，轻轻晃动柱子，使凝胶悬浮，而后，摘掉柱底的小塞，以及柱顶小塞，在大气压强的作用下，不至于产生大量气泡，让液
【参考文献】：
期刊论文
[1]Response of Platanus orientalis leaves to urban pollution by heavy metals[J]. Esmaiel Khosropour,Pedram Attarod,Anoushirvan Shirvany,Thomas Grant Pypker,Vilma Bayramzadeh,Leila Hakimi,Mazaher Moeinaddini. Journal of Forestry Research. 2019(04)
[2]超富集植物藿香蓟（Ageratum conyzoides L.）对镉污染农田的修复潜力[J]. 张云霞,宋波,宾娟,周子阳,陈记玲,陈同斌. 环境科学. 2019(05)
[3]高灵敏甲胎蛋白夹心免疫传感器的制备[J]. 王雪,李鹏君,邱萍,王小磊. 分析化学. 2017(08)
[4]孔雀草对镉胁迫的响应及其积累与分布特征[J]. 王明新,陈亚慧,白雪,潘新星,高琪. 环境化学. 2014(11)
[5]蓖麻对镉的耐性、积累及与镉亚细胞分布的关系[J]. 陈亚慧,刘晓宇,王明新,王静,严新美. 环境科学学报. 2014(09)
[6]外源铜胁迫对木本蔬菜生长及品质的影响研究[J]. 李晓晶,李德生,李海茹,孟丽,周金倩,杨晶晶,吴强. 环境污染与防治. 2013(04)
[7]水杨酸对Cd2+胁迫下小麦的影响[J]. 黄希莲,魏菲. 湖北农业科学. 2012(14)
[8]铜胁迫对萝卜幼苗根系生理生化指标的影响[J]. 韩春梅. 江苏农业科学. 2010(01)
[9]RNA提取过程中DEPC的毒性[J]. 王长晔. 天津科技. 2008(05)
[10]大蒜金属硫蛋白家族新成员AsMT2b在镉离子胁迫下的功能分析[J]. 张海燕,徐文忠,戴文韬,何振艳,麻密. 科学通报. 2006(03)
博士论文
[1]电化学免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用研究[D]. 李胜昔.复旦大学 2012
[2]苎麻对重金属吸收和积累特征及镉胁迫响应基因表达研究[D]. 佘玮.湖南农业大学 2010
硕士论文
[1]快速检测食品中痕量铅、镉、铜的电化学传感方法的研究[D]. 翁芝莹.上海交通大学 2012
本文编号：3573979
【文章来源】：昆明理工大学云南省
【文章页数】：110 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pUC57-SbMT2载体图谱
昆明理工大学硕士学位论文28图2.2Cd2+标准曲线Fig.2.2Cd2+standardcurve2.1.10.2烟草植株各部分镉含量测定溶液中Cd2+的检测：吸取100μL处理液与100μLB-R溶液混合（1：1）。叶表面：将叶片平铺与培养皿中，每个培养皿中加入10mLB-R溶液，为放置溶液挥发使用保鲜膜封闭，每隔1～2min将叶片翻转，保证叶片表面的Cd2+析出，10min后收集溶液，洗涤叶片之前，将叶片放于A4纸上画出轮廓，剪下，称量其重量，剪一张已知面积的A4纸，通过比例间接计算叶片的表面积，计算单位面积的Cd2+含量。根、茎、叶：去离子水清洗表面吸干水分，液氮研磨滴加1mLB-R溶液抽提，震荡离心，收集上清液。2.1.11植物样品中MF-α-EGFP-SbMT2/OsMT2蛋白的测定2.1.11.1EGFP蛋白标准曲线的测定实验室，蛋白表达的测定常用WesternBlot分析技术，但这一方法存在一些弊端，比如操作较为繁琐，需要染色、脱色转膜等，而且在检测过程中蛋白需求量有较高要求。有人运用电化学免疫方法来分析蛋白，如制备甲胎蛋白免疫传感器，在肿瘤标志物的测定等方向研究较广[126]，此方法检测速度较快、灵敏度较高。参考李胜昔[127]等人的方法，采用物理组装将EGFP兔抗（捕获探针）吸附在印刷电极表面，随后将待检测物即待检测的蛋白物理吸附在其表面，然后连接信号探针（将EGFP兔抗采用特异性结合的方法进行生物素标记），SA-HRP（辣根过氧化物酶标记链霉亲和素）会和生物素亲和连接，在印刷电极表面结合，使
昆明理工大学硕士学位论文29用电化学工作站检测，辣根过氧化物酶催化底物的氧化还原电流得以检测。实验原理见图3.4。图2.3丝网印刷电极检测蛋白含量原理示意图Fig.2.3schematicdiagramofscreenprintingelectrodedetectionproteincontentSchematicdiagramofscreenprintedelectrodedetectionprotein生物素标记EGFP兔抗的获得（1）标记方法a.将5mgBiotion-XX-NHS溶解在250μLDMF中；b.将EGFP兔抗蛋白溶解在0.01mol/L的磷酸缓冲液（PBS）中；c.Biotin与EGFP兔抗蛋白按照1:1体积比例混合（由于需要标记的EGFP兔抗100μL，故此处的Biotin与EGFP抗体蛋白分别为60μL，以免在过凝胶柱的时候量不足，影响实验结果），并且在室温下超声震荡1h；d.反应液过凝胶柱，以0.01mol/LpH=7.4的磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白部分，为不含游离Biotin的结合物。（2）凝胶柱的使用凝胶柱大约有3mL的凝胶体积，凝胶的量限制了可被纯化的空间，所以，最多100μL的蛋白液加至柱床。a.首先，为使凝胶沉积（驱除气泡），需要加入一定体积的磷酸缓冲液（PBS），一般与柱床体积的量一致，如2mL，轻轻晃动柱子，使凝胶悬浮，而后，摘掉柱底的小塞，以及柱顶小塞，在大气压强的作用下，不至于产生大量气泡，让液
【参考文献】：
期刊论文
[1]Response of Platanus orientalis leaves to urban pollution by heavy metals[J]. Esmaiel Khosropour,Pedram Attarod,Anoushirvan Shirvany,Thomas Grant Pypker,Vilma Bayramzadeh,Leila Hakimi,Mazaher Moeinaddini. Journal of Forestry Research. 2019(04)
[2]超富集植物藿香蓟（Ageratum conyzoides L.）对镉污染农田的修复潜力[J]. 张云霞,宋波,宾娟,周子阳,陈记玲,陈同斌. 环境科学. 2019(05)
[3]高灵敏甲胎蛋白夹心免疫传感器的制备[J]. 王雪,李鹏君,邱萍,王小磊. 分析化学. 2017(08)
[4]孔雀草对镉胁迫的响应及其积累与分布特征[J]. 王明新,陈亚慧,白雪,潘新星,高琪. 环境化学. 2014(11)
[5]蓖麻对镉的耐性、积累及与镉亚细胞分布的关系[J]. 陈亚慧,刘晓宇,王明新,王静,严新美. 环境科学学报. 2014(09)
[6]外源铜胁迫对木本蔬菜生长及品质的影响研究[J]. 李晓晶,李德生,李海茹,孟丽,周金倩,杨晶晶,吴强. 环境污染与防治. 2013(04)
[7]水杨酸对Cd2+胁迫下小麦的影响[J]. 黄希莲,魏菲. 湖北农业科学. 2012(14)
[8]铜胁迫对萝卜幼苗根系生理生化指标的影响[J]. 韩春梅. 江苏农业科学. 2010(01)
[9]RNA提取过程中DEPC的毒性[J]. 王长晔. 天津科技. 2008(05)
[10]大蒜金属硫蛋白家族新成员AsMT2b在镉离子胁迫下的功能分析[J]. 张海燕,徐文忠,戴文韬,何振艳,麻密. 科学通报. 2006(03)
博士论文
[1]电化学免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用研究[D]. 李胜昔.复旦大学 2012
[2]苎麻对重金属吸收和积累特征及镉胁迫响应基因表达研究[D]. 佘玮.湖南农业大学 2010
硕士论文
[1]快速检测食品中痕量铅、镉、铜的电化学传感方法的研究[D]. 翁芝莹.上海交通大学 2012
本文编号：3573979
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