枯草芽孢杆菌ATCC6051宿主构建及表达元件、蛋白折叠功能基因的研究

发布时间：2022-01-12 01:40

　　枯草芽孢杆菌表达系统具有生物安全性高、遗传背景清晰、蛋白分泌能力强等突出特点,广泛地应用于生产和表达各种外源蛋白。本研究旨在利用无痕敲除技术和胞外蛋白谱构建无抗性标记的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表达宿主、采用转录组学技术和信号肽库筛选挖掘最优表达元件以及分析Sec分泌途径中折叠相关基因功能的研究,建立具有应用潜力的枯草芽孢杆菌高效表达系统。本文先通过温敏型质粒pKS2无痕敲除体系失活了B.subtilis ATCC 6051的八种蛋白酶编码基因（nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA）,一个芽孢形成因子F编码基因spollAC和surfactin合成酶编码基因srfAC,成功构建了B.subtilis无抗性标记、不产孢子且副产物少的宿主;并以B.subtilis 168为参照做相对应的研究。将茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）来源的转谷氨酰胺酶酶原（proMTG）和嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus）来源的耐热半乳糖苷酶（BgaB）验证表达宿主的重组蛋白可行性,菌株B.su... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：179 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
第一章 绪论
    1.1 枯草芽孢杆菌概述
    1.2 枯草芽孢杆菌表达系统概述
        1.2.1 枯草芽胞杆菌表达系统的特点
        1.2.2 枯草芽胞杆菌表达宿主
        1.2.3 枯草芽胞杆菌表达系统的载体
        1.2.4 枯草芽胞杆菌表达系统的元件
        1.2.5 枯草芽孢杆菌蛋白质分泌机制
        1.2.6 枯草芽孢杆菌表达系统的应用
        1.2.7 存在的问题
    1.3 本论文立题依据与研究内容
        1.3.1 立题依据及研究意义
        1.3.2 主要研究内容
        1.3.3 技术路线
第二章 B.subtilisATCC6051宿主的构建及其表达特性、胞外蛋白组学的研究
    2.1 引言
    2.2 实验材料与方法
        2.2.1 主要仪器和设备
        2.2.2 菌种和质粒
        2.2.3 主要试剂
        2.2.4 所用引物序列
        2.2.5 细菌培养基
    2.3 实验方法
        2.3.1 细菌的培养
        2.3.2 质粒的构建
        2.3.3 枯草芽孢杆菌的转化
        2.3.4 枯草芽孢杆菌基因缺陷菌株的构建
        2.3.5 枯草芽孢杆菌的发酵培养
        2.3.6 枯草芽孢杆菌基因缺陷株的胞外分泌蛋白分析
        2.3.7 蛋白表达重组菌株的培养
        2.3.8 酶活测定方法
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 B.subtilisATCC6051生长特性及宿主的构建
        2.4.2 B.subtilisATCC6051宿主胞外分泌蛋白谱的研究
        2.4.3 B.subtilisATCC6051宿主表达特性的研究
    2.5 本章小结
第三章 基于转录组数据对芽孢杆菌中不同类型启动子的研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料与方法
        3.2.1 主要仪器和设备
        3.2.2 菌种和质粒
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 细菌培养基
        3.2.5 所用引物序列
    3.3 实验方法
        3.3.1 细菌的培养
        3.3.2 RNA-seq样品的制备
        3.3.3 cDNA建库及测序
        3.3.4 RNA-Seq数据的拼接及基因表达情况
        3.3.5 RNA-seq生物信息学分析
        3.3.6 质粒的构建
        3.3.7 启动子筛选菌株的构建及培养
        3.3.8 启动子的序列分析
        3.3.9 强启动子的应用
        3.3.10 酶活测定方法
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 RNA样品的制备与分析
        3.4.2 基于RNA-Seq数据对三株芽孢杆菌的分析
        3.4.3 芽孢杆菌不同类型启动子的研究
        3.4.4 强启动子的重组表达效率的研究
    3.5 本章小结
第四章 Sec途径类型信号肽的分泌效率研究
    4.1 引言
    4.2 实验仪器和材料
        4.2.1 主要仪器设备
        4.2.2 主要试剂
        4.2.3 细菌培养基
        4.2.4 菌种和质粒
        4.2.5 所用引物序列
    4.3 实验方法
        4.3.1 菌体的培养
        4.3.2 质粒的构建
        4.3.3 信号肽重组菌株的构建
        4.3.4 酶活测定方法
        4.3.5 信号肽的分析
        4.3.6 高效分泌信号肽的应用
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体的构建
        4.4.2 Sec类型信号肽对BgaB分泌效率的研究
        4.4.3 信号肽LytF对不同外源蛋白分泌效率的研究
        4.4.4 Sec途径类型信号肽对proMTG分泌效率的研究
        4.4.5 Sec类型信号肽对AmyM分泌效率的研究
        4.4.6 信号肽AprE对不同外源蛋白分泌效率的研究
    4.5 本章小结
第五章 转谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌中高效表达的应用研究
    5.1 引言
    5.2 实验材料与方法
        5.2.1 主要仪器设备
        5.2.2 菌种和质粒
        5.2.3 主要试剂
        5.2.4 培养基和溶液的配制
        5.2.5 所用引物序列
    5.3 实验方法
        5.3.1 菌体的培养
        5.3.2 质粒的构建
        5.3.3 重组菌株的发酵培养
        5.3.4 发酵液中葡萄糖含量的测定
        5.3.5 胞外总蛋白分泌量的检测
        5.3.6 重组蛋白样品的亲和层析纯化
        5.3.7 酶活测定方法
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 重组表达载体的构建
        5.4.2 proMTG高效表达系统重组菌在摇瓶发酵的研究
        5.4.3 proMTG高效表达系统重组菌在5L发酵罐培养的研究
        5.4.4 proMTG高效表达系统重组菌的SDS-PAGE分析
    5.5 本章小结
第六章 Sec分泌途径中折叠相关功能基因研究
    6.1 引言
    6.2 实验材料与方法
        6.2.1 主要仪器设备
        6.2.2 菌种和质粒
        6.2.3 主要试剂
        6.2.4 细菌培养基
        6.2.5 所用引物序列
    6.3 实验方法
        6.3.1 菌体的培养
        6.3.2 基因序列预测及分析
        6.3.3 质粒的构建
        6.3.4 重组菌的构建
        6.3.5 重组菌的培养和酶活测定方法
    6.4 结果与讨论
        6.4.1 Sec分泌途径基因改造工程菌株的构建
        6.4.2 Sec分泌途径折叠相关基因改造的研究
        6.4.3 三个不同来源PrsA蛋白与proMTG共表达的研究
        6.4.4 B.megateriumPrsA蛋白与AmyM共表达的研究
    6.5 本章小结
结论和展望
    结论
    本论文创新点
    展望
参考文献
附录
攻读博士学位期间取得的研究成果
致谢
附件


【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽孢杆菌对桑椹采后致腐微生物的抑菌作用[J]. 陈成,方银,金超,李少辉,陈会娟,贾俊强,桂仲争.  蚕业科学. 2016(01)
[2]基因在分离重组中的熵增与制约[J]. 陈奇,韦文惠,李大林.  上海交通大学学报(农业科学版). 2007(01)
[3]枯草芽孢杆菌抗菌蛋白X98Ⅲ的纯化与性质[J]. 谢栋,彭憬,王津红,胡剑,王岳五.  微生物学报. 1998(01)
[4]基因工程原理[J]. 纪实.  生物工程进展. 1990(02)

博士论文
[1]Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D]. 杨森.江南大学 2017
[2]枯草芽孢杆菌及链霉菌表达系统的构建及应用研究[D]. 关成冉.江南大学 2016
[3]解淀粉芽孢杆菌转录组学及其表达元件的挖掘与应用[D]. 廖瑜玲.华南理工大学 2016
[4]枯草芽孢杆菌中Sec分泌途径底物特性及非经典分泌途径的研究[D]. 王光强.江南大学 2013
[5]枯草芽孢杆菌关键遗传调控元件及表达系统的研究[D]. 杨明明.西北农林科技大学 2013
[6]基于全基因组测序和系统生物学分析的鸟苷工业生产菌分子育种研究[D]. 杨慧林.华南理工大学 2012
[7]枯草芽孢杆菌食品级表达系统的构建和分泌表达研究[D]. 夏雨.江南大学 2007

硕士论文
[1]嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶的分子改造及高效表达[D]. 孙烨橙.江南大学 2016
[2]α-淀粉酶的异源表达、调控元件优化和分泌瓶颈鉴定[D]. 陈景奇.天津大学 2015
[3]茂源链霉菌转谷氨酰胺酶的异源表达研究[D]. 王坤.华南理工大学 2013
[4]外源木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中信号肽筛选[D]. 范鑫.西北农林科技大学 2011
[5]枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体的构建及木聚糖酶基因（xynA）的表达[D]. 段春燕.西北农林科技大学 2010



本文编号：3583849