利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因
发布时间：2022-01-12 22:52
链霉菌（Streptomyces）是活性产物的重要来源,其次级代谢产物应用广泛,可作为抗真菌药物、抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗高血压药、免疫抑制剂以及抗生素等。近年来从链霉菌发现新化合物的几率不断下降。但是基因组学研究结果显示链霉菌含有编码20个或更多潜在次级代谢物的基因,其中仅一部分在发酵过程中表达,说明链霉菌含有大量沉默基因,在新化合物发掘和新药研发方面仍有巨大潜力。本文期望通过CRISPR-Cas9技术靶向链霉菌rpsL基因引入K88E和P91S突变,改变核糖体稳定性,激发链霉菌自身次级代谢物合成潜能,即通过核糖体工程打开链霉菌次级代谢产物的合成途径。在模式菌株天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor 1147中K88E和P91S突变是激活效果较为明显的两种突变。CRISPR-Cas9技术在链霉菌中的应用是相对新颖的课题,最早的见刊文献在2014年年末。建立高效、普遍适用的基因组编辑系统对于后续唤醒沉默基因及优化菌株都具有极其重要的意义。本文首先针对链霉菌建立了一套CRISPR-Cas9系统,人工合成了 pCas9-1质粒,对11株海绵共附生链霉菌进行遗传操作。测...
【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：101 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１?１９４０Ｓ至１９９０Ｓ每年从链霉菌中发现抗菌成分趋势图［９］??
??防止攻击自身基因组［４５，５８］。Ｃａｓ９蛋白（如图１．２蓝色）行使剪切ＤＮＡ的功能，??使ＤＮＡ产生双链断裂（ＤＳＢ）?［３３］。此时，细胞会进行基因修复，如系统中没有??供体ＤＮＡ分子（ＨＲ模板）存在，会通过ＮＥＨＪ途径修复，在基因组测序中表??现为基因组片段的缺失。如系统中存在供体ＤＮＡ分子，便可进行同源重组修复??（ＨＲ）。利用该途径，在修复过程中便可借助供体ＤＮＡ分子实现基因的插入或??突变＠５９］。如果在同一系统中设计两个ｓｐａｃｅｒ就可特异删除某一片段，删除片??段的长度范围可在２０?ｂｐ至８２．８?ｋｂ［６Ｇ，６Ｉ］。??ｓｇＲＮＡ??＿?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｔｏ??＾％／ａｓ９??Ｍａｔｃｈｉｎｇ?ＤＮＡ?邏?ＰＡＭ??ｔａｒｇｅｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?．?ｓｅｑｕｅｎｃｅ??图１．２?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９示意图丨３３】??Ｆｉｇ．１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＣＲ１ＳＰＲ－Ｃａｓ９??１．３．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术在链霉菌基因组编辑中的应用??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术在链霉菌中的应用相关文献主要集中在近３年，研宄对象??包括研宄背景较为清楚的模式菌株
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【参考文献】：
期刊论文
[1]链霉菌次级代谢物及其应用研究进展[J]. 代芳平,李师翁. 生物技术通报. 2014(03)
[2]链霉菌无痕敲除方法研究进展[J]. 谷燕燕,耿伟涛,宋存江. 生物工程学报. 2013(08)
[3]放线菌野生株代谢功能的核糖体工程改造与新产抗肿瘤活性产物研究[J]. 韩晓,崔承彬,韩小贤,李长伟,杨明. 国际药学研究杂志. 2009(06)
[4]微生物核糖体工程研究进展[J]. 谢庶洁,肖静,徐俊. 微生物学报. 2009(08)
[5]链霉菌次级代谢研究进展[J]. 李欧,缪克排. 中国抗生素杂志. 2005(11)
[6]链霉菌次级代谢调控机制进展[J]. 张艳娟,洪斌. 中国生物工程杂志. 2004(12)
博士论文
[1]十一烷基灵菌红素（metacycloprodigiosin）的提取分离及抗肿瘤活性研究[D]. 李雪萍.中国海洋大学 2009
硕士论文
[1]两株链霉菌次级代谢产物研究[D]. 赖珍珠.广州医科大学 2017
[2]链霉菌抗生素生物合成基因簇中调控基因作用机制的初步研究[D]. 黄璐瑶.华中师范大学 2014
[3]海洋来源产木聚糖酶的链霉菌菌种筛选与代谢工程改造[D]. 刘卓.大连理工大学 2013
本文编号：3585597
【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：101 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１?１９４０Ｓ至１９９０Ｓ每年从链霉菌中发现抗菌成分趋势图［９］??
??防止攻击自身基因组［４５，５８］。Ｃａｓ９蛋白（如图１．２蓝色）行使剪切ＤＮＡ的功能，??使ＤＮＡ产生双链断裂（ＤＳＢ）?［３３］。此时，细胞会进行基因修复，如系统中没有??供体ＤＮＡ分子（ＨＲ模板）存在，会通过ＮＥＨＪ途径修复，在基因组测序中表??现为基因组片段的缺失。如系统中存在供体ＤＮＡ分子，便可进行同源重组修复??（ＨＲ）。利用该途径，在修复过程中便可借助供体ＤＮＡ分子实现基因的插入或??突变＠５９］。如果在同一系统中设计两个ｓｐａｃｅｒ就可特异删除某一片段，删除片??段的长度范围可在２０?ｂｐ至８２．８?ｋｂ［６Ｇ，６Ｉ］。??ｓｇＲＮＡ??＿?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｔｏ??＾％／ａｓ９??Ｍａｔｃｈｉｎｇ?ＤＮＡ?邏?ＰＡＭ??ｔａｒｇｅｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?．?ｓｅｑｕｅｎｃｅ??图１．２?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９示意图丨３３】??Ｆｉｇ．１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＣＲ１ＳＰＲ－Ｃａｓ９??１．３．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术在链霉菌基因组编辑中的应用??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术在链霉菌中的应用相关文献主要集中在近３年，研宄对象??包括研宄背景较为清楚的模式菌株
??防止攻击自身基因组［４５，５８］。Ｃａｓ９蛋白（如图１．２蓝色）行使剪切ＤＮＡ的功能，??使ＤＮＡ产生双链断裂（ＤＳＢ）?［３３］。此时，细胞会进行基因修复，如系统中没有??供体ＤＮＡ分子（ＨＲ模板）存在，会通过ＮＥＨＪ途径修复，在基因组测序中表??现为基因组片段的缺失。如系统中存在供体ＤＮＡ分子，便可进行同源重组修复??（ＨＲ）。利用该途径，在修复过程中便可借助供体ＤＮＡ分子实现基因的插入或??突变＠５９］。如果在同一系统中设计两个ｓｐａｃｅｒ就可特异删除某一片段，删除片??段的长度范围可在２０?ｂｐ至８２．８?ｋｂ［６Ｇ，６Ｉ］。??ｓｇＲＮＡ??＿?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｔｏ??＾％／ａｓ９??Ｍａｔｃｈｉｎｇ?ＤＮＡ?邏?ＰＡＭ??ｔａｒｇｅｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?．?ｓｅｑｕｅｎｃｅ??图１．２?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９示意图丨３３】??Ｆｉｇ．１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＣＲ１ＳＰＲ－Ｃａｓ９??１．３．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术在链霉菌基因组编辑中的应用??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术在链霉菌中的应用相关文献主要集中在近３年，研宄对象??包括研宄背景较为清楚的模式菌株
【参考文献】：
期刊论文
[1]链霉菌次级代谢物及其应用研究进展[J]. 代芳平,李师翁. 生物技术通报. 2014(03)
[2]链霉菌无痕敲除方法研究进展[J]. 谷燕燕,耿伟涛,宋存江. 生物工程学报. 2013(08)
[3]放线菌野生株代谢功能的核糖体工程改造与新产抗肿瘤活性产物研究[J]. 韩晓,崔承彬,韩小贤,李长伟,杨明. 国际药学研究杂志. 2009(06)
[4]微生物核糖体工程研究进展[J]. 谢庶洁,肖静,徐俊. 微生物学报. 2009(08)
[5]链霉菌次级代谢研究进展[J]. 李欧,缪克排. 中国抗生素杂志. 2005(11)
[6]链霉菌次级代谢调控机制进展[J]. 张艳娟,洪斌. 中国生物工程杂志. 2004(12)
博士论文
[1]十一烷基灵菌红素（metacycloprodigiosin）的提取分离及抗肿瘤活性研究[D]. 李雪萍.中国海洋大学 2009
硕士论文
[1]两株链霉菌次级代谢产物研究[D]. 赖珍珠.广州医科大学 2017
[2]链霉菌抗生素生物合成基因簇中调控基因作用机制的初步研究[D]. 黄璐瑶.华中师范大学 2014
[3]海洋来源产木聚糖酶的链霉菌菌种筛选与代谢工程改造[D]. 刘卓.大连理工大学 2013
本文编号：3585597
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