谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因敲除和重组工程介导的点突变方法的探索

发布时间：2022-01-17 05:39

　　基因重组是可用于基因克隆、基因修饰的一种分子生物学技术,操作简单而高效,对于基因表征的研究具有重要的价值和意义。本论文主要研究谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因敲除和重组工程介导的点突变。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032及其衍生菌株是工业上用于生产氨基酸的重要生产菌株。染色体基因敲除的研究将有助于研究基因表征和蛋白质功能。为克服目前的方法效率低的问题,探索比较各系统的敲除效率,以期建立一个适用于谷氨酸棒状杆菌的高效简便基因编辑方法。首先,通过调节I-SceI基因之前的核糖体结合位点获得更高水平的基因表达。尽管打靶DNA片段通过重组工程成功替代了抗性基因,但第二步抗性基因的去除未能通过短同源臂介导的重组而实现。将同源臂延伸至1 kb后,由自杀载体介导的基因敲除成功实现了无痕敲除。高敲除效率显示了此法具有作为有效基因敲除策略的强大潜力。通过构建Cre诱导型表达载体和crtI2基因缺失载体,初步测试了另一种基因敲除系统——Cre/loxP介导的基因敲除系统。最后,构建了 IPTG诱导的recT-cas9基因表达载体,将用于单链DNA辅助的CRISPR/Cas9介导的染色体基因编辑。本... 

【文章来源】：南京师范大学江苏省 211工程院校

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１?Ｗ１菌体Ｒｅｄ介导的同源重组过程??人噬菌体Ｒｅｄ介导的同源重组过程［４］（图１）

植物细胞中的遗传操作。Ａｌｂｅｒｔ等［３９］报道了一系列可被识别重组的突变／ｏｘＰ位??点，为Ｃｒｅ／／ｏｘＰ系统的广泛应用提供了保证。??利用Ｃｒｅ／ｆｃｘＰ系统进行基因敲除的一般方法如图２所示??ｐ＃遥粒矗欤??ｐＣＲＡ４ｌ９??Ｕ?ｉａｃＺ??［＞Ｃ?ＬＥ?ｍｕｔｍｔ?ｋｉｘＴｉ?ＲＦ；?ｎｍｉｔｍｉ?！ｍ６６?＞＜］???ｉ?ｉ?？／＿??Ｇｅｎｏｒｎｇ??ＧＲ１?１＾．???????｜＾｜?ＧＲ２??Ｔａｒｇｅｔ?ｒｅｇｉｃｅｉｆ?１０?－?５６?ｋｂ）??——Ｃ＝＾＜］［＾ｒ｜Ｊ＝＝］???Ｖ???????Ｊ??Ｈ．?ｃｏｌｉ?＾??ｅ＇ｉ?＾?Ｃｒｅ?ｒｃｅ＾ｓｉ＇ｓｂｉｎ＾ｓｃ－ｍｅｄｉａｉｅｄ?ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ??ｋ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ???１????Ｃｏｒｙ?Ｗｏｒｍ?ｆ．，??图２?Ｃｒｅ／ｔｏｃＰ介导的谷氨酸棒状杆菌大片段敲除示意图??为卡那霉素抗性基因；办ｒ为大观霉素抗性基因；ｂｃＺ为半乳糖酶编码基因；ＧＲ１和??ＧＲ２为ＰＣＲ扩增获得的谷氨酸棒状杆菌短片段基因并通过重组整合入质粒中。黑色箭头（Ｐ１??和Ｐ２）为ＰＣＲ引物??在构建三个不同抗性的质粒后，转入Ｃｒｅ表达质粒，即将／ｏｘＰ位点插入目??的基因片段的两端，并验证两／ｏｘＰ位点为同方向；完成重组后，设法去除质粒??或留在菌体内。但利用Ｃｒｅ／／〇ｘＰ系统完成一次敲除后，基因组上会残留一个／ｏｘＰ??位点而影响后续实验操作，不利于在同一菌株中进行二次敲除。后来发现了多种??变异丨ｏｘ位点

图３?ＣＲＩＳＰＲ的位点结构??ＣＲＩＳＰＲ由一系列短的高度保守的正向重复序列（ｒｅｐｅａｔｓ）与长度相似的间隔??序列（ｓｐａｃｅｒｓ）间隔排列组成，如图３所示。存在于ＣＲＩＳＰＲ位点附近一系列??ＣＲＩＳＰＲ?相关基因（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｇｅｎｅｓ，?Ｃａｓ?ｇｅｎｅｓ），是?ＣＲＩＳＰＲ?免疫防御途??径中的基本组成成分，往往与ＣＲＩＳＰＲ位点的重复序列相连。ｃｍ基因是一类较??大的多态性基因家族，编码的蛋白质具有与核酸相关的功能域以及与核酸酶、聚??合酶、解旋酶等结合的活性，Ｃａｓ蛋白通过位点特异性的切割将入侵ＤＮＡ切断。??不同的基因在宿主应对外源ＤＮＡ入侵时发挥着不同的作用；且在不同的物??种中，ｏｗ基因的种类也各不相同，表达出多种同源但功能不相关的Ｃａｓ蛋白［５１１??ＣＲＩＳＰＲ位点的第一个重复序列上游是ＣＲＩＳＰＲ前导序列（Ｌｅａｄｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ），启动??ＣＲＩＳＰＲ序列的转录［５２］，转录产生的非编码ＲＮＡ被命名为ＣＲＩＳＰＲ?ＲＮＡｓ??（ｃｒＲＮＡｓ）［５３］

【参考文献】：
期刊论文
[1]基于染色体的重组工程系统的改进[J]. 樊丹,石牡丹,杨运文,尚广东.  南京师大学报(自然科学版). 2013(01)
[2]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波.  遗传. 2011(03)
[3]唾液酸的研究进展[J]. 刘志东,王荫榆,郭本恒,刘振民,苏米亚,李云飞,高红艳.  食品工业科技. 2010(04)
[4]基于重叠延伸PCR法的定点突变技术[J]. 戴灿,苗聪秀,卢光琇.  现代生物医学进展. 2010(03)
[5]重叠延伸PCR法构建小鼠Sumf1基因的定点突变真核表达载体[J]. 帅勇,胡兴旺,易朵,王成,赵晓蒙,周畅.  生命科学研究. 2009(05)
[6]大肠杆菌同源重组工程研究进展[J]. 原志伟,朱国强.  中国家禽. 2007(15)
[7]重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用[J]. 徐芳,姚泉洪,熊爱生,彭日荷,侯喜林,曹兵.  分子植物育种. 2006(05)
[8]运用重叠PCR技术构建HCV全长cDNA细胞培养适应性突变体[J]. 孙梦宁,薛小平,尹文,吕欣,雷迎峰,韦三华,胡兴斌,杨敬.  生物技术通讯. 2006(01)
[9]基于PCR的体外诱变技术[J]. 罗师平,冷希岗.  国外医学(生物医学工程分册). 2005(03)
[10]唾液酸类化合物的合成研究进展[J]. 李连生,刘克刚,姚祝军,吴毓林.  有机化学. 2002(10)



本文编号：3594146