L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因挖掘与分子改造
发布时间：2022-01-20 09:52
L-天冬氨酸β-脱羧酶（L-aspartate-β-decarboxylase,EC 4.1.1.12,Asd）催化L-天冬氨酸脱去β位羧基生成L-丙氨酸,工业上用于生产L-丙氨酸。L-丙氨酸在食品、日化以及医药等领域具有广泛应用,酶法生产L-丙氨酸具有副产物少、立体选择性强、催化效率高等优点。本研究通过从土壤中筛选菌株,挖掘具有高酶活力的Asd,利用大肠杆菌进行异源表达,对Asd酶进行酶学性质表征与分子改造后,偶联L-天冬氨酸裂解酶,构建了双酶共表达的重组大肠杆菌,建立了全细胞催化富马酸合成L-丙氨酸的工艺。主要研究结果如下:（1）成功筛选到Acinetobacter radioresistens来源L-天冬氨酸β-脱羧酶（ArAsd）并对其进行酶学性质表征。在富含氨基酸的土壤中筛选获得一株具有Asd活性的菌株,菌种鉴定为Acinetobacter radioresistens。克隆获得ArAsd基因后构建表达载体pET-28a（+）-ArAsd并在E.coli BL21（DE3）中进行异源表达,在ArAsd蛋白氨基酸序列N端添加His标签,利用镍柱纯化成功获得电泳纯目的蛋白。采用凝...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
L-天冬氨酸β-脱羧酶催化反应方程式Fig.1-1ReactionrouteofL-aspartate-β-decarboxylase
组合为十二聚体时有重要作用；偏碱性的环境会造成Asd分子松散化，随着pH值升高，酶分子逐渐解聚为二聚体，酶活逐渐降低。Lima[1]等人发现P.dacunhae来源Asd的活性中心位于单聚体界面，辅酶因子PLP与Lys315形成席夫碱，PLP磷酸基团与Arg37、Tyr134（另一个亚基）、Gly174、Thr175、Ser312、Ser314、Arg323形成氢键，PLP吡啶氮原子与Asp286、Tyr207形成氢键，PLP吡啶环氧原子与Asn256、Tyr289形成氢键，Arg37覆盖在催化中心表面，控制底物和产物的进出。Asd单体三维结构（PDBID:3fdd）（PDB:ProteinDataBank）如图1-2所示。图1-2L-天冬氨酸β-脱羧酶的三维立体结构注：A：Asd单体三维立体结构；B：Asd十二聚体三维立体结构Fig.1-2TertiarystructureofL-aspartate-β-decarboxylase1.1.3L-天冬氨酸β-脱羧酶的分子改造研究酶蛋白的稳定性决定了该酶在工业领域的应用可行性。虽然Asd已被应用于工业生产L-丙氨酸，但由于其在偏酸条件下稳定性较差且底物专一性较差，Asd的转化效率被大大限制，为提高其底物专一性及底物催化转化效率，已有多位研究人员利用分子生物学方法对Asd进行改造。为了探索Asd的脱羧与转氨的差异关键性位点，Wang[9]等人通过比对多个L-天冬氨酸氨基转移酶与Asd的氨基酸序列，选择了在转氨酶序列中保守但在脱羧酶中具有差异的Ser298、Tyr207和Pro257突变为对应位置的转氨酶上的氨基酸，酶活检测表明Ser298Arg的二级结构发生改变，蛋白十二聚体的三维结构解聚为脱羧酶活性几乎完全丧失的二聚体；Tyr207His和Pro257His的突变因位于酶活中心而导致酶蛋白活性几乎完全丧失，但蛋白质二级结构与三维结构未发生明显变化。Wang[3]等人也对Asd和L-天冬氨酸氨基转移酶的差异保守残基进行了研究，突变株F204W对底物的转氨酶活力发生明显增
92.3%。Asd也可以用来拆分DL-天冬氨酸生产D-天冬氨酸[22]。1975年，Kokai[17]利用固定化Asd来制备D-天冬氨酸，但该过程中释放的CO2会破坏固定化柱，降低生产效率。1989年，Masaru[23]等对固定化反应器进行了优化设计，采用高压柱式反应器，提高了生产效率，实现了D-天冬氨酸的工业化生产。1.2L-丙氨酸概述1.2.1L-丙氨酸的性质与应用L-丙氨酸（L-Alanine，L-Ala）是最小的手性分子之一，分子式为C3H7NO2，相对分子量为89.09。熔点为297oC，密度为1.432g·cm-1，是一种人体非必需氨基酸。分子结构如下图1-3所示。图1-3L-丙氨酸的化学结构式Fig.1-3ChemicalstructureofL-alanineL-丙氨酸在医药、食品、日化、化工合成等方面用途十分广泛[24]。医药领域：L-丙氨酸是制备维生素B6和L-2-氨基丙醇的中间体[25,26]。维生素B6参与人体内氨基酸循环、氨基酸与糖原转换等多种代谢过程，是人体必需的维生素之一，可单独或者与其他药物复合用于治疗多种皮肤炎症疾病[27]，维生素B6在治疗贫血、白细胞减少症、帕金森综合症和妊娠糖尿病等方面也有着广泛的新用途[28,29]。L-2-氨基丙醇可用于合成左旋氧氟沙星，该药物对细菌、支原体、衣原体有很好的消杀抑制作用，在临床上可用于治疗各种细菌性感染。同时，L-丙氨酸是可用于复合氨基酸注射液，也可用作心肌功能增强剂。在配制组织培养基和生化试剂以及肝功能检测是，L-丙氨酸也
【参考文献】：
期刊论文
[1]赤拟谷盗来源天冬氨酸α-脱羧酶分子改造及催化合成β-丙氨酸工艺的建立[J]. 王超,叶文琪,薛岚,刘中美,周哲敏. 食品与发酵工业. 2019(11)
[2]L-丙氨酸生产工艺的研究进展[J]. 田宋魁,郭恒华,张冬竹,章晖. 精细与专用化学品. 2017(08)
[3]L-丙氨酸在食品工业中的应用潜力[J]. 郭媛,王丽娟,邱婷,陆震鸣,章晖,史劲松,许正宏. 中国调味品. 2017(07)
[4]氢键型N-马来酰-L-丙氨酸/PVA旋光性聚合物的合成[J]. 翟宁,牛小玲. 合成树脂及塑料. 2016(05)
[5]HPLC法测定复方维生素B6凝胶剂中维生素B6与醋酸氟轻松的含量[J]. 纪万里,要辉,沈定文. 中国药师. 2016(06)
[6]天冬氨酸酶基因工程菌固定化细胞制备L-天冬氨酸合成条件优化[J]. 徐礼生,高贵珍,赵亮,曹稳根,张兴桃,陈军,焦庆才,鲍妮娜. 精细化工. 2016(03)
[7]重组大肠杆菌转化富马酸生产L-丙氨酸[J]. 徐友强,马玉岳,姚粟,姜增妍,张奇,张露,裴疆森,程池. 生物加工过程. 2016(02)
[8]全细胞催化合成阿糖胞苷工艺的研究[J]. 李鹏,潘婕,周鸣飞. 氨基酸和生物资源. 2015(03)
[9]重组表达天冬氨酸-β-脱羧酶及其酶学性质[J]. 吴四平,陆阳,张宏娟,刘茜,焦庆才,刘均忠. 精细化工. 2015(06)
[10]L-天冬氨酸的生产与应用进展[J]. 李仲福,卞涛. 天津化工. 2015(01)
硕士论文
[1]Pseudomonas dacunhae L-天冬氨酸β-脱羧酶的耐酸性分子改造及催化合成L-丙氨酸研究[D]. 汪芳.江南大学 2018
[2]马来酸顺反异构酶热稳定性改造及L-天冬氨酸的生物合成[D]. 余龙.江南大学 2018
[3]纳豆激酶热稳定性及pH稳定性的改造研究[D]. 赵菡.江南大学 2018
[4]鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的酶活、最适pH及稳定性改造[D]. 张帆.江南大学 2017
[5]复方维生素B6凝胶剂的制备及质量控制研究[D]. 纪万里.湖北科技学院 2016
[6]产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽的研究[D]. 朱健.苏州大学 2014
本文编号：3598613
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
L-天冬氨酸β-脱羧酶催化反应方程式Fig.1-1ReactionrouteofL-aspartate-β-decarboxylase
组合为十二聚体时有重要作用；偏碱性的环境会造成Asd分子松散化，随着pH值升高，酶分子逐渐解聚为二聚体，酶活逐渐降低。Lima[1]等人发现P.dacunhae来源Asd的活性中心位于单聚体界面，辅酶因子PLP与Lys315形成席夫碱，PLP磷酸基团与Arg37、Tyr134（另一个亚基）、Gly174、Thr175、Ser312、Ser314、Arg323形成氢键，PLP吡啶氮原子与Asp286、Tyr207形成氢键，PLP吡啶环氧原子与Asn256、Tyr289形成氢键，Arg37覆盖在催化中心表面，控制底物和产物的进出。Asd单体三维结构（PDBID:3fdd）（PDB:ProteinDataBank）如图1-2所示。图1-2L-天冬氨酸β-脱羧酶的三维立体结构注：A：Asd单体三维立体结构；B：Asd十二聚体三维立体结构Fig.1-2TertiarystructureofL-aspartate-β-decarboxylase1.1.3L-天冬氨酸β-脱羧酶的分子改造研究酶蛋白的稳定性决定了该酶在工业领域的应用可行性。虽然Asd已被应用于工业生产L-丙氨酸，但由于其在偏酸条件下稳定性较差且底物专一性较差，Asd的转化效率被大大限制，为提高其底物专一性及底物催化转化效率，已有多位研究人员利用分子生物学方法对Asd进行改造。为了探索Asd的脱羧与转氨的差异关键性位点，Wang[9]等人通过比对多个L-天冬氨酸氨基转移酶与Asd的氨基酸序列，选择了在转氨酶序列中保守但在脱羧酶中具有差异的Ser298、Tyr207和Pro257突变为对应位置的转氨酶上的氨基酸，酶活检测表明Ser298Arg的二级结构发生改变，蛋白十二聚体的三维结构解聚为脱羧酶活性几乎完全丧失的二聚体；Tyr207His和Pro257His的突变因位于酶活中心而导致酶蛋白活性几乎完全丧失，但蛋白质二级结构与三维结构未发生明显变化。Wang[3]等人也对Asd和L-天冬氨酸氨基转移酶的差异保守残基进行了研究，突变株F204W对底物的转氨酶活力发生明显增
92.3%。Asd也可以用来拆分DL-天冬氨酸生产D-天冬氨酸[22]。1975年，Kokai[17]利用固定化Asd来制备D-天冬氨酸，但该过程中释放的CO2会破坏固定化柱，降低生产效率。1989年，Masaru[23]等对固定化反应器进行了优化设计，采用高压柱式反应器，提高了生产效率，实现了D-天冬氨酸的工业化生产。1.2L-丙氨酸概述1.2.1L-丙氨酸的性质与应用L-丙氨酸（L-Alanine，L-Ala）是最小的手性分子之一，分子式为C3H7NO2，相对分子量为89.09。熔点为297oC，密度为1.432g·cm-1，是一种人体非必需氨基酸。分子结构如下图1-3所示。图1-3L-丙氨酸的化学结构式Fig.1-3ChemicalstructureofL-alanineL-丙氨酸在医药、食品、日化、化工合成等方面用途十分广泛[24]。医药领域：L-丙氨酸是制备维生素B6和L-2-氨基丙醇的中间体[25,26]。维生素B6参与人体内氨基酸循环、氨基酸与糖原转换等多种代谢过程，是人体必需的维生素之一，可单独或者与其他药物复合用于治疗多种皮肤炎症疾病[27]，维生素B6在治疗贫血、白细胞减少症、帕金森综合症和妊娠糖尿病等方面也有着广泛的新用途[28,29]。L-2-氨基丙醇可用于合成左旋氧氟沙星，该药物对细菌、支原体、衣原体有很好的消杀抑制作用，在临床上可用于治疗各种细菌性感染。同时，L-丙氨酸是可用于复合氨基酸注射液，也可用作心肌功能增强剂。在配制组织培养基和生化试剂以及肝功能检测是，L-丙氨酸也
【参考文献】：
期刊论文
[1]赤拟谷盗来源天冬氨酸α-脱羧酶分子改造及催化合成β-丙氨酸工艺的建立[J]. 王超,叶文琪,薛岚,刘中美,周哲敏. 食品与发酵工业. 2019(11)
[2]L-丙氨酸生产工艺的研究进展[J]. 田宋魁,郭恒华,张冬竹,章晖. 精细与专用化学品. 2017(08)
[3]L-丙氨酸在食品工业中的应用潜力[J]. 郭媛,王丽娟,邱婷,陆震鸣,章晖,史劲松,许正宏. 中国调味品. 2017(07)
[4]氢键型N-马来酰-L-丙氨酸/PVA旋光性聚合物的合成[J]. 翟宁,牛小玲. 合成树脂及塑料. 2016(05)
[5]HPLC法测定复方维生素B6凝胶剂中维生素B6与醋酸氟轻松的含量[J]. 纪万里,要辉,沈定文. 中国药师. 2016(06)
[6]天冬氨酸酶基因工程菌固定化细胞制备L-天冬氨酸合成条件优化[J]. 徐礼生,高贵珍,赵亮,曹稳根,张兴桃,陈军,焦庆才,鲍妮娜. 精细化工. 2016(03)
[7]重组大肠杆菌转化富马酸生产L-丙氨酸[J]. 徐友强,马玉岳,姚粟,姜增妍,张奇,张露,裴疆森,程池. 生物加工过程. 2016(02)
[8]全细胞催化合成阿糖胞苷工艺的研究[J]. 李鹏,潘婕,周鸣飞. 氨基酸和生物资源. 2015(03)
[9]重组表达天冬氨酸-β-脱羧酶及其酶学性质[J]. 吴四平,陆阳,张宏娟,刘茜,焦庆才,刘均忠. 精细化工. 2015(06)
[10]L-天冬氨酸的生产与应用进展[J]. 李仲福,卞涛. 天津化工. 2015(01)
硕士论文
[1]Pseudomonas dacunhae L-天冬氨酸β-脱羧酶的耐酸性分子改造及催化合成L-丙氨酸研究[D]. 汪芳.江南大学 2018
[2]马来酸顺反异构酶热稳定性改造及L-天冬氨酸的生物合成[D]. 余龙.江南大学 2018
[3]纳豆激酶热稳定性及pH稳定性的改造研究[D]. 赵菡.江南大学 2018
[4]鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的酶活、最适pH及稳定性改造[D]. 张帆.江南大学 2017
[5]复方维生素B6凝胶剂的制备及质量控制研究[D]. 纪万里.湖北科技学院 2016
[6]产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽的研究[D]. 朱健.苏州大学 2014
本文编号：3598613
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