利用多重gRNA介导的CRISPR/Cas技术对拟南芥IAA2和小立碗藓LrgB基因编辑的研究

发布时间：2022-01-20 16:12

　　IAA2是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员,这类基因在植物生长发育中起着非常重要的作用,但是目前该基因的失去功能型突变体还没有报道,阻碍了对其功能和作用机制的深入研究。小立碗藓由于配子体占主导地位,容易培养,容易发生同源重组,是一种新型的模式植物。拟南芥的LrgB基因与光呼吸和细胞死亡调控有关,小立碗藓中有两个LrgB同源基因,分别为PpLrgB1和PpLrgB2,但是具体功能还不清楚。CRISPR （clustered regulatory interspersed short palindromic repeat- associated endonuclease）是细菌和古菌抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。Ⅱ型CRISPR/Cas已被改造成一种高效的基因组定点编辑技术。与锌指核酸酶（ZFN）和类转录激活样效应器核酸酶（TALEN）相比,CRISPR/Cas9系统具有操作简单、突变率高、费用节省等优点,在各种模式生物和农作物中广泛使用。在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中,一个gRNA只能靶向基因的一个位点,有时基因敲除的效率并不高。本文中,为了提高敲除效... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 CRISPR/Cas系统
        1.1.1 CRISPR/Cas系统的研究历史
        1.1.2 CRISPR/Cas系统的基本结构和类型
        1.1.3 CRISPR/Cas系统的作用机制
        1.1.4 作为基因组编辑技术CRISPR/Cas系统与ZFN,TELEN的比较
        1.1.5 CRISPR系统的应用与发展
    1.2 IAA2研究背景
    1.3 小立碗藓的研究进展
第二章 材料和方法
    2.1 实验材料
    2.2 原始载体
    2.3 入门载体的构建
        2.3.1 gRNA靶位点的选择
        2.3.2 单个gRNA表达框的扩增
        2.3.3 三个gRNA表达框的扩增和串联
        2.3.4 转化及阳性克隆鉴定
    2.4 目的载体的构建
    2.5 表达载体的构建
    2.6 转基因、筛选及种子萌发
        2.6.1 拟南芥的培养
        2.6.2 电转化
        2.6.3 转基因
        2.6.4 筛选
        2.6.5 种子萌发
    2.7 数据收集
        2.7.1 DNA水平的数据收集
        2.7.2 目的基因的扩增
        2.7.3 突变体的检测
    2.8 小立碗藓原丝体的培养
    2.9 小立碗藓原生质体的制备
    2.10 PEG介导的转化
第三章 实验结果
    3.1 序列查找与靶位点设计
    3.2 两轮PCR法串联多个gRNA表达框的优点
    3.3 拟南芥IAA2 T_0代突变的鉴定
    3.4 拟南芥IAA2 T_1代突变的鉴定
    3.5 IAA2突变体测序结果及突变形式
    3.6 表型观察与分析
    3.7 PEG介导的小立碗藓原生质体转基因
第四章 讨论
参考文献
致谢
附录



本文编号：3599132