CRISPR/Cas12a系统介导的水稻基因编辑和定点基因替换体系的构建及优化

发布时间：2022-08-02 16:01

　　作为世界上最重要的粮食作物之一,水稻生产关系到我国乃至世界的粮食安全。随着人口增长、全球气候变暖、耕地面积和水资源减少,我国水稻生产面临着巨大挑战。以CRISPR/Cas系统为代表的基因编辑技术可对靶标基因进行定点敲除、插入、替换等。大多数农作物优异等位基因差异主要是少数几个碱基或小片段插入/缺失引起,通过基因编辑介导的同源重组技术,可快速实现优异等位基因精准替换,大大缩短育种周期。但由于同源重组发生概率极低,特别是植物细胞含有细胞壁,无法将足量的修复模板递送到细胞中,CRISPR/Cas介导的等位基因替换效率偏低,成功报道较少,已成为利用基因编辑进行农作物等位基因替换的技术瓶颈和该领域的研究热点及竞争焦点。CRISPR/Cas12a（Cpf1）属于II类type V CRISPR系统,具有组装简单、脱靶效率低等优点,但识别的5’-TTTV-3’PAM限制了CRISPR/Cas12a的应用范围。此外,CRISPR/Cas12a产生的交错切割可能会促进同源重组的发生,但在植物中尚未有利用CRISPR/Cas12a进行等位基因替换的报道。本论文从以下几方面进行了研究,并取得如下进展:1)构... 

【文章页数】：113 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
    1.1 CRISPR/Cas系统类型
        1.1.1 DNA靶向的CRISPR/Cas系统
        1.1.2 RNA靶向的CRISPR/Cas系统
    1.2 CRISPR/Cas系统介导的基因编辑和修复
        1.2.1 基因敲除
        1.2.2 单碱基编辑
        1.2.3 基因替换和定点整合
        1.2.4 基因表达调控
    1.3 CRISPR/Cas12a的作用机制研究进展
    1.4 植物基因编辑介导的基因同源重组研究概述
        1.4.1 植物基因同源重组研究进展
        1.4.2 植物基因同源重组存在问题
        1.4.3 植物基因同源重组研究与应用展望
    1.5 本论文研究内容、技术路线及研究目的和意义
        1.5.1 研究内容
        1.5.2 技术路线
        1.5.3 研究的目的和意义
第二章 Cas12a突变体扩展CRISPR/Cas12a系统在水稻中的应用范围
    2.1 引言
    2.2 实验材料和方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验方法
    2.3 实验结果
        2.3.1 敲除载体的构建
        2.3.2 对T_0代再生植株的基因型鉴定
        2.3.3 水稻基因组的生物信息学分析
        2.3.4 脱靶分析
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 CRISPR/Cas12a系统介导的以DNA为修复模板的水稻基因定点替换
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验方法
    3.3 实验结果
        3.3.1 同源重组载体的构建
        3.3.2 同源重组载体活性检测
        3.3.3 T_0代再生植株的基因型鉴定
        3.3.4 脱靶分析
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 CRISPR/Cas12a系统介导的以RNA为修复模板的水稻基因片段定点替换
    4.1 引言
    4.2 实验材料和方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验方法
    4.3 实验结果
        4.3.1 同源重组载体的构建
        4.3.2 水稻愈伤中以RNA转录本为修复模板的基因片段替换
        4.3.3 利用ddPCR检测不同实验处理的同源重组效率
        4.3.4 T_0代再生植株的精准编辑基因型鉴定
        4.3.5 脱靶分析
        4.3.6 T_1代编辑植株孟德尔遗传分析
        4.3.7 编辑植株表型鉴定
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 结论与展望
    5.1 全文结论
    5.2 展望
参考文献
附录A
附录B
致谢
作者简历



本文编号：3668820