11个水稻冷响应相关基因的筛选与突变体鉴定
发布时间：2022-08-06 17:44
水稻是重要的单子叶模式作物,也是我国主要的粮食作物之一。水稻在生长发育中,低温冷害是常见的问题。研究水稻耐冷性的分子生理机制对我国水稻高产高效生产和粮食安全具有重要意义。为了研究低温在水稻中的作用机制,最直接有效的工具就是构建水稻突变体,基因敲除是实现该目标的最有效方法。本研究从水稻低温表达芯片中挑选了11个受低温胁迫诱导表达的基因,利用CRISPR/Cas9技术创制了8个基因的功能缺失突变体,以及3个购自RISD（Rice T-DNA Insertion Sequence Database）的T-DNA突变体,研究这些基因与耐冷性的关系,主要结果如下:1.水稻低温响应基因的筛选:根据日本晴幼苗低温芯片基因表达谱筛选出11个低温响应基因（Metall、UL、WRKY45、WI12、ADT、RBP、OS2、POT、PRP、CP12和RCI2-6）。qRT-PCR检测了这11个基因在4℃条件下诱导表达水平,发现PRP基因的表达受诱导最为显著;WRKY45和WI12基因在4℃诱导表达也明显;ADT、RBP、OS2和POT基因受低温诱导水平较低;而Metall、UL、CP12和RCI2-6基因...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写名词表
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 文献综述
1.2.1 低温对植物的影响
1.2.2 植物感受低温的机制
1.2.3 胁迫信号转导
1.2.4 与冷有关的调控基因与功能基因研究
1.2.5 利用基因编辑技术研究冷响应相关基因的功能
1.2.6 CRISPR/Cas9系统
1.3 研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株和质粒
2.1.3 酶与试剂
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 CTAB法抽提水稻DNA
2.2.2 水稻总RNA抽提和qRT-PCR检测基因表达量
2.2.3 亚细胞定位
2.2.4 CRISPR/Cas9靶位点的选择
2.2.5 CRISPR/Cas9多靶位点构建
2.2.6 农杆菌介导的遗传转化
2.2.7 CRISPR/Cas9转基因植株的阳性检测
2.2.8 CRISPR/Cas9转基因靶位点鉴定
2.2.9 比较测序
3 结果与分析
3.1 水稻冷胁迫响应相关基因的筛选
3.1.1 水稻冷响应相关基因在水稻幼苗4℃下的诱导表达
3.1.2 水稻冷响应相关基因T-DNA突变体分析
3.2 Metall、UL和WRKY45蛋白的亚细胞定位
3.2.1 Metall、UL和WRKY45亚细胞定位载体构建
3.2.2 Metall、UL和WRKY45蛋白在水稻原生质体中的亚细胞定位
3.3 Metall、UL和WRKY45纯合突变体与DJ的农艺性状考察
3.4 Metall、UL和WRKY45T-DNA纯合突变体的耐冷性鉴定
3.4.1 MetallT-DNA纯合突变体的耐冷性鉴定
3.4.2 UL和WRKY45T-DNA纯合突变体的耐冷性鉴定
3.4.3 T-DNA纯合突变体与野生型DJ 4℃处理前后的表达分析
3.5 利用CRISPR/Cas9技术创建冷相关基因缺失突变体
3.5.1 构建CRISPR/Cas9载体时靶位点的选择
3.5.2 构建CRISPR/Cas9双靶位点载体
3.5.3 CRISPR/Cas9功能缺失突变体植株的获得
3.6 冷响应相关基因的编辑位点检测
3.6.1 WI12基因的编辑位点检测
3.6.2 RBP基因的编辑位点检测
3.6.3 OS2基因的编辑位点检测
3.6.4 POT基因的编辑位点检测
3.6.5 PRP基因的编辑位点检测
3.6.6 ADT基因的编辑位点检测
3.6.7 CP12和RCI2-6基因双突变体编辑位点检测
3.7 CRISPR/Cas9转基因植株引起的突变情况和突变频率
4 讨论
4.1 关于P-56株系特殊编辑位点的可能性分析
4.2 如何提高CRISPR/Cas9系统在靶位点处正确的编辑效率
4.3 运用正、反向遗传学方法研究冷响应相关基因的功能
4.4 提高水稻抗寒性方法的展望
参考文献
附录
致谢
本文编号：3670086
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写名词表
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 文献综述
1.2.1 低温对植物的影响
1.2.2 植物感受低温的机制
1.2.3 胁迫信号转导
1.2.4 与冷有关的调控基因与功能基因研究
1.2.5 利用基因编辑技术研究冷响应相关基因的功能
1.2.6 CRISPR/Cas9系统
1.3 研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株和质粒
2.1.3 酶与试剂
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 CTAB法抽提水稻DNA
2.2.2 水稻总RNA抽提和qRT-PCR检测基因表达量
2.2.3 亚细胞定位
2.2.4 CRISPR/Cas9靶位点的选择
2.2.5 CRISPR/Cas9多靶位点构建
2.2.6 农杆菌介导的遗传转化
2.2.7 CRISPR/Cas9转基因植株的阳性检测
2.2.8 CRISPR/Cas9转基因靶位点鉴定
2.2.9 比较测序
3 结果与分析
3.1 水稻冷胁迫响应相关基因的筛选
3.1.1 水稻冷响应相关基因在水稻幼苗4℃下的诱导表达
3.1.2 水稻冷响应相关基因T-DNA突变体分析
3.2 Metall、UL和WRKY45蛋白的亚细胞定位
3.2.1 Metall、UL和WRKY45亚细胞定位载体构建
3.2.2 Metall、UL和WRKY45蛋白在水稻原生质体中的亚细胞定位
3.3 Metall、UL和WRKY45纯合突变体与DJ的农艺性状考察
3.4 Metall、UL和WRKY45T-DNA纯合突变体的耐冷性鉴定
3.4.1 MetallT-DNA纯合突变体的耐冷性鉴定
3.4.2 UL和WRKY45T-DNA纯合突变体的耐冷性鉴定
3.4.3 T-DNA纯合突变体与野生型DJ 4℃处理前后的表达分析
3.5 利用CRISPR/Cas9技术创建冷相关基因缺失突变体
3.5.1 构建CRISPR/Cas9载体时靶位点的选择
3.5.2 构建CRISPR/Cas9双靶位点载体
3.5.3 CRISPR/Cas9功能缺失突变体植株的获得
3.6 冷响应相关基因的编辑位点检测
3.6.1 WI12基因的编辑位点检测
3.6.2 RBP基因的编辑位点检测
3.6.3 OS2基因的编辑位点检测
3.6.4 POT基因的编辑位点检测
3.6.5 PRP基因的编辑位点检测
3.6.6 ADT基因的编辑位点检测
3.6.7 CP12和RCI2-6基因双突变体编辑位点检测
3.7 CRISPR/Cas9转基因植株引起的突变情况和突变频率
4 讨论
4.1 关于P-56株系特殊编辑位点的可能性分析
4.2 如何提高CRISPR/Cas9系统在靶位点处正确的编辑效率
4.3 运用正、反向遗传学方法研究冷响应相关基因的功能
4.4 提高水稻抗寒性方法的展望
参考文献
附录
致谢
本文编号：3670086
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3670086.html
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