烟草维生素B 6 代谢酶磷酸吡哆醛磷酸酶基因的克隆与分析

发布时间：2022-10-08 13:06

　　维生素B₆包含六种可以相互转换的吡啶类化合物,它们分别是:吡哆醇（P-ridoxine,PN）,吡哆醛（Pyridoxal,PL）,吡哆胺（Pyridoxamin,PM）;以及对应的磷酸酯形式:磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5’-phosphate,PNP）,磷酸吡哆醛（P yridoxal-5’-phosphate,PLP）和磷酸吡哆胺（Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP）。其中PLP是VB₆的活性形式,是140多种酶的辅酶,涉及氨基酸的多种反应,在许多物质的合成、代谢转换过程中发挥着重要作用。PLP在维持机体生化稳态方面具有重要作用,包括:生物体内氨基酸的代谢以及它自身化学结构的特点,活泼的醛基使它极易与含有氨基的化合物结合,生成醛亚胺类物质对生命体的正常活动产生影响。因此必须将VB₆中的其他形式转化为PLP。通常参与代谢的酶有ATP依赖性PL激酶和FMN依赖性PNP氧化酶。而PLP的水解是控制细胞内游离PLP水平的一个重要机制,因此可催化PLP水解的磷酸酶对维持生物体内PLP浓度在一个正... 

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 维生素B_6简介及其在生物体内的作用
    1.2 维生素B_6的生物合成
    1.3 生物体内维生素B_6的代谢转换
    1.4 磷酸酶论述
        1.4.1 磷酸酶简介
        1.4.2 PLP磷酸酶研究进展
    1.5 RNAi简介
2 引言
    2.1 研究背景与意义
    2.2 研究内容
3 材料与方法
    3.1 材料、实验设备及主要试剂
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 主要实验设备
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 常用试剂配制(见表3-1)
    3.2 实验方法
        3.2.1 序列分析
        3.2.2 烟草磷酸吡哆醛磷酸酶基因克隆
        3.2.3 构建原核表达载体
        3.2.4 重组蛋白的表达与分析
        3.2.5 NtPLPP酶活的测定
        3.2.6 NtPLPPRNAi载体的构建
        3.2.7 农杆菌侵染烟草叶片
        3.2.8 荧光定量检测
        3.2.9 烟草NtPLPP基因的亚细胞定位
4 实验结果与分析
    4.1 烟草NtPLPP cDNA序列分析
    4.2 烟草NtPLPP基因的克隆
        4.2.1 烟草NtPLPP cDNA的获得
        4.2.2 烟草NtPLPP基因的克隆
    4.3 烟草NtPLPP的原核表达
        4.3.1 烟草NtPLPP原核表达载体的构建
        4.3.2 NtPLPP的目的蛋白诱导
    4.4 蛋白浓度的测定
    4.5 NtPLPP的部分酶学性质分析
        4.5.1 最适pH值
        4.5.2 酶促反应的最适温度
        4.5.3 酶促反应时间
        4.5.4 对不同底物的催化活性比较
    4.6 RNAi载体的构建
        4.6.1 沉默片段的PCR扩增
        4.6.2 反向干扰片段载体构建
        4.6.3 正向干扰片段载体构建
        4.6.4 内参基因稳定性检测
        4.6.5 烟草NtPLPP的RNAi瞬时沉默效率检测
        4.6.6 烟草NtPLPP瞬时沉默后VB_6代谢其他相关基因的变化
    4.7 烟草NtPLPP基因亚细胞定位的分析
5 讨论
    5.1 NtPLPP的氨基酸序列分析
    5.2 烟草磷酸吡哆醛磷酸酶的最适反应条件
    5.3 底物特异性分析
    5.4 NtPLPP基因RNAi效果
    5.5 NtPLPP对其它VB_6代谢相关酶基因表达的影响
    5.6 NtPLPP基因的亚细胞定位分析
6 结论
    6.1 NtPLPP基因的克隆、序列分析
    6.2 酶学性质分析
    6.3 NtPLPPRNAi载体沉默效果以及对代谢相关基因的影响
    6.4 亚细胞定位分析
参考文献
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]RNAi载体构建新方法及其在植物次生代谢调控中的应用[J]. 曲子越,李影,李林夕,王朝焕,王敏,尹静.  中草药. 2017(07)
[2]磷酸吡哆醛补救途径两个关键酶的研究进展[J]. 黄龙全,张剑韵.  安徽农业大学学报. 2015(06)
[3]植物维生素B6从头合成与代谢转换研究进展[J]. 黄龙全,张剑韵.  西北植物学报. 2015(10)
[4]农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究[J]. 孙蔓莉,孟玉玲,张强,黄桂艳,单卫星.  西北农业学报. 2015(01)
[5]农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化[J]. 吴英杰,姜波,张岩,李彦邦,贺琳,王玉成.  东北林业大学学报. 2010(09)
[6]植物中RNA干扰技术的研究与应用[J]. 陈李淼,赵琳,郝迪萩,李文滨.  东北农业大学学报. 2009(10)
[7]植物RNA干扰表达载体构建方法的研究[J]. 马建,魏益凡,厉志,王丕武.  安徽农业科学. 2009(18)
[8]拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达[J]. 邓克勤,郭新红,汪启明,刘选明.  西北植物学报. 2009(02)
[9]维生素B6缺乏对大鼠学习记忆的影响及有关机制的探讨[J]. 洪燕,王冬兰,李树田,程义勇.  中国行为医学科学. 2000(02)

硕士论文
[1]响应低磷的大豆蛋白磷酸酶GmHAD1亚家族生化和功能分析[D]. 莫小惠.华南农业大学 2016
[2]烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征[D]. 马娅萍.安徽农业大学 2012
[3]拟南芥VSP1蛋白酸性磷酸酶活性及初步晶体学研究[D]. 史竹兵.安徽大学 2010



本文编号：3687769