绵羊肺炎支原体延伸因子EF-P基因的克

发布时间：2024-07-06 08:52

　　为筛选绵羊肺炎支原体(MO)免疫相关蛋白,以MO新疆流行株基因组DNA为模板,通过PCR扩增其EF-P基因,测序后对其编码蛋白进行分子特征分析;用生物信息学软件预测其抗原表位集中区编码片段;进一步将该基因片段克隆入pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-EF-P,将pET-32a(+)-EF-P质粒转化至感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达后,检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDS-PAGE结果显示,EF-P重组蛋白分子质量为29.5ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体,采用正向间接血凝方法检测效价可达1∶64,提示其具有较强的免疫原性。

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【部分图文】：

图１ＭＯＥＦ－Ｐ基因的ＰＣＲ扩增Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１～４．菌液ＰＣＲ产物ＰＣＲｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄ

４个Ｎ－酰基化位点，在５１～６６位氨基酸处有１个ＧＴＰ结合延伸因子标签（图２）。利用在线软件ＢｅｐｉＰｒｅｄ１．０ｂＳｅｒｖｅｒ预测发现，在１０９～２０５位氨基酸处有４个优势抗原表位；经ＤＮＡＭＡＮ分析发现在该区域内不存在终止密码子，可正常翻译；ＭｏｔｉｆＳｃａｎ在线软件分析发现....

图３ＰＳＩＰＲＥＤ软件预测的ＥＦ－Ｐ二级与三级结构Ｆｉｇ．３Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ

双酶切后得到目的片段和ｐＥＴ－３２ａ（＋）载体片段（图６），表明成功构建重组表达质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）－ＥＦ－Ｐ。２．５表达产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，ＩＰＴＧ诱导的样品在２９．５ｋｕ处有明显条带，且与理论分析值相符，重组菌在ＩＰ....

图４ＥＦ－Ｐ基因系统进化关系Ｆｉｇ．４ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｅｃｉｅｓｂａｓｅｄｏｎＥＦ－Ｐｇｅｎｅ

分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，ＩＰＴＧ诱导的样品在２９．５ｋｕ处有明显条带，且与理论分析值相符，重组菌在ＩＰＴＧ诱导８ｈ时表达量达到最高。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果表明，重组蛋白可被ＭＯ阳性血清识别，说明重组蛋白ＥＦ－Ｐ具有较好的反应原性（图７）。图３ＰＳＩＰＲＥＤ软件预测的....

图５ＥＦ－Ｐ的ＰＣＲ鉴定Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１～３．菌液ＰＣＲ产物ＰＣＲｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄ

（图７）。图３ＰＳＩＰＲＥＤ软件预测的ＥＦ－Ｐ二级与三级结构Ｆｉｇ．３ＰｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＥＦ－ＰｂｙｕｓｉｎｇＰＳＩＰＲＥＤｓｏｆｔｗａｒｅ图４ＥＦ－Ｐ基因系统进化关系Ｆｉｇ．４ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＭｙ....

本文编号：4002352