转BtCry1Ac欧洲黑杨的外源基因插入位点分析及特异性检测

发布时间：2024-07-07 01:05

　　【目的】分析转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因插入位点,从而进一步完善抗虫转基因杨树的背景信息,推进抗虫转基因杨树的安全评价及应用。【方法】以转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12、n222为试验材料,使用高效热不对称交错PCR法(hiTAIL-PCR)分离外源基因插入位点侧翼序列,比对毛果杨基因组序列确定插入位点。根据插入位点处的侧翼序列设计2对特异性PCR检测引物,建立转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因特异性PCR检测方法,并利用实时荧光定量PCR技术分析插入位点周边基因表达情况。【结果】PCR及半定量PCR结果表明,转基因欧洲黑杨株系的BtCry1Ac基因稳定表达。通过比对毛果杨基因组序列确定转基因杨n12 T-DNA插入基因组Chr15的10162773位点即Potri.015G076600第2个内含子,其碱基组成AT含量为65%; n222整合位点为基因组Chr01基因间隔区41596184位点,其碱基组成AT含量为69%。特异性PCR检测显示,n12能扩增出709 bp(转基因)和1 159 bp(非转基因)特异性条带,n222及其与丹红杨杂交子代能扩增出1 265 bp(转...

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【部分图文】：

图1PCR检测转基因植株及转基因表达量

将转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12右边界hiTAIL-PCR的第2轮和第3轮扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离，以AC1、RB-1A为引物的第2轮和AC1、RB-2A为引物的第3轮扩增结果如图2A所示。随机引物LAD3第3轮产物应比第2轮小80bp(图2A)。将随机引....

图2转BtCry1Ac欧洲黑杨n12右边界序列

图1PCR检测转基因植株及转基因表达量2.3转BtCry1Ac欧洲黑杨n222及其杂交子代的T-DNA插入位点

图3转BtCry1Ac欧洲黑杨n222左边界序列

转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n222的4条随机引物第2轮和第3轮产物电泳，发现简并引物LAD4的第2、3轮产物相差89bp(图3A)，将条带回收连接T载体，并测序获得215bpDNA片段，1-122bp为载体序列，123-215bp与毛果杨数据库比对发现与1号染色体4....

图4转BtCry1Ac欧洲黑杨n12(上)、n222(下)插入位点序列特异性检测引物位置

株系n12插入Potri.015G076600第2个内含子，编码丝氨酸蛋白激酶(serine-proteinkinase,SPK);下游2.7kb处为Potri.015G076700共济失调毛细血管扩张症突变家族蛋白(ataxiatelangiectasiamutated....

本文编号：4002913