白星花金龟免疫基因干扰及其对中肠微生物群落的影响

发布时间：2022-12-09 03:05

　　白星花金龟（Protaetia brevitarsis）严重危害棉花、果树等经济作物的生产,危害生态环境。由于其飞行能力较强,缺少天敌等特点导致防治困难,所以目前正逐步将防治目标着眼于对白星花金龟的生物学防治。实验室前期研究发现苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）HBF18等菌株可以有效破坏蛴螬肠道结构,然而最终没有导致其死亡。实验室前期研究发现,白星花金龟幼虫血淋巴液和肠道分离菌株对Bt菌株的生长有抑制作用,推测Bt菌株杀虫效果不理想的原因可能与蛴螬免疫及其肠道内生菌有关。本文即通过对免疫相关基因进行干扰,分析免疫相关基因对蛴螬中肠内生菌群落结构的影响,进一步分析其对Bt菌株抵抗能力的影响。1.白星花金龟免疫基因筛选克隆、pgrp1、gnbp、tab和pgrp-lb四个免疫相关基因,通过生物息学结合dsRNA设计评分选择其dsRNA片段。2.白星花金龟免疫干扰体系构建（1）将dsRNA片段通过L4440质粒在HT115菌株中表达富集,并优化dsRNA表达体系,发现在接菌浓度为OD值2,IPTG为5 mmol/L时表达效果较好。（2）通过对注射dsRNA... 

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【学位级别】：硕士

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摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 白星花金龟的危害及其防治
        1.1.1 白星花金龟的危害
        1.1.2 白星花金龟的防治
        1.1.3 Bt菌株对蛴螬生物防治中的应用
    1.2 昆虫免疫与中肠微生物
        1.2.1 昆虫免疫
        1.2.2 昆虫中肠内生菌群落结构稳态的生理意义
        1.2.3 昆虫与肠道内生菌的互作
    1.3 RNAI在昆虫防治中的应用
        1.3.1 昆虫RNAi的发展及原理
        1.3.2 dsRNA导入方式及RNAi效率影响因素
        1.3.3 RNAi在昆虫中的应用
    1.4 本实验目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 供试昆虫
        2.1.2 供试菌株与质粒
        2.1.3 实验主要培养基及抗生素
        2.1.4 实验主要酶及试剂盒
        2.1.5 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 蛴螬中肠总RNA提取、纯化及反转录
        2.2.2 免疫相关基因筛选及克隆测序
        2.2.3 免疫相关基因生物信息学分析
        2.2.4 dsRNA表达载体的构建
        2.2.5 dsRNA表达体系
        2.2.6 蛴螬干扰注射体系
        2.2.7 Real-time PCR检测目的基因相对表达量
        2.2.8 蛴螬中肠内容物16S rRNA基因测序及分析
        2.2.9 干扰不同免疫基因后对Bt菌株敏感性影响
3 实验结果
    3.1 蛴螬免疫基因的筛选与克隆
        3.1.1 白星花金龟幼虫中肠免疫相关基因的筛选及克隆
        3.1.2 白星花金龟幼虫中肠免疫相关基因生物信息学分析
    3.2 蛴螬干扰体系构建结果
        3.2.1 dsRNA干扰质粒的构建及表达结果
        3.2.2 dsRNA表达体系优化结果
        3.2.3 蛴螬干扰体系的优化结果
    3.3 蛴螬免疫基因干扰的影响
        3.3.1 蛴螬免疫基因干扰
        3.3.2 蛴螬免疫基因干扰对中肠内容物细菌群落结构的影响
        3.3.3 蛴螬免疫基因干扰对Bt菌株敏感性的影响
4 讨论
5 结论
    5.1 成功克隆并构建了免疫相关基因 pgrp-lb、pgrp1、gnbp 和 tab干扰载体
    5.2 优化了菌株表达 ds RNA 体系
    5.3 建立了白星花金龟幼虫免疫相关基因干扰体系
    5.4 初步明晰了免疫基因干扰处理对蛴螬中肠细菌群落结构的影响
    5.5 明晰了免疫基因干扰对蛴螬 Bt 菌株敏感性的影响
致谢
参考文献
攻读硕学位期间发表的学术论文
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]蝇蛆肠道微生物菌群对猪粪残留抗生素的降解及抗性基因的影响[J]. 江承亮,李鸿毅,王行,腾昌运,冯诗韵,楼莉萍,张志剑.  微生物学报. 2018(06)
[2]巴彦淖尔市近年新发的几种害虫及防治措施[J]. 韩艳茹,何忠萍,杨茹洁,尚江红,张宇,乔娜,李秀荣,杜瑞芬,高万兵,高海燕,张红萍.  现代农业. 2017(08)
[3]博州地区白星花金龟分布及发生规律[J]. 赛丽蔓·马木提.  农业科技通讯. 2017(07)
[4]饲喂玉米秸秆的白星花金龟幼虫肠道细菌多样性[J]. 田小燕,宋福平,张杰,刘荣梅,张兴鹏,段江燕,束长龙.  昆虫学报. 2017(06)
[5]内参基因在昆虫实时荧光定量PCR中的研究进展[J]. 史彩华,张友军.  应用昆虫学报. 2016(02)
[6]苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白研究进展[J]. 彭琦,周子珊,张杰.  中国生物防治学报. 2015(05)
[7]用于RNA干扰研究的大肠杆菌表达系统的条件优化[J]. 姚琼,董易之,徐淑,徐海明,陈炳旭.  安徽农业科学. 2015(24)
[8]昆虫酚氧化酶原激活酶研究[J]. 陈晓宇,时敏,陈学新.  应用昆虫学报. 2015(02)
[9]显微注射构建烟粉虱的RNAi技术体系[J]. 李如美,王少丽,张友军.  应用昆虫学报. 2015(02)
[10]不同引诱剂对白星花金龟的引诱效果比较[J]. 王萍莉,李小万,饶晓娟.  黑龙江农业科学. 2014(12)

博士论文
[1]对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究[D]. 闫贵欣.中国农业科学院 2009

硕士论文
[1]不同地理种群白星花金龟亲缘关系的鉴定[D]. 索中毅.新疆农业大学 2015
[2]苏云金芽胞杆菌与环境微生物的相互作用研究[D]. 单月明.东北农业大学 2014
[3]白星花金龟生物学及其对玉米秸秆取食习性的研究[D]. 杨诚.山东农业大学 2014
[4]德国小蠊（Blattella germanica）的种群特性及控制策略研究[D]. 霍京.山东师范大学 2012
[5]白星花金龟幼虫血淋巴抗菌物质的分离、纯化及其PGRP-S基因的克隆分析[D]. 徐明旭.南京农业大学 2008



本文编号：3714688