分枝杆菌三个耐药新基因的鉴定与功能研究

发布时间：2022-12-09 23:00

　　结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）仍然是全球最成功的致病菌之一。结核病难以治疗的症结在于结核菌的持留性、耐药性和毒力性,其中耐药性结核分枝杆菌是治疗的重难点。据世界卫生组织估计,2019年由吡嗪酰胺（Pyrazinamide）和氟喹诺酮类（Fluoroquinolone）耐药结核菌引起的新发结核病例至少为630万例,而其中多耐药病例为49万例。此外,由于多耐药（MDR）和广耐药（XDR）结核病的发病率越来越高,可用于治疗结核病的抗生素越来越少。为了更有效治愈结核病患者,必须开发新的治疗方案。结核分枝杆菌细胞壁和细胞膜是结核菌抵抗抗生素和宿主免疫杀菌的重要屏障。分枝杆菌细胞膜是一种复杂的多层结构,主要由5个重要部分组成:质膜（Plasma Membrane,PM）、肽聚糖（Peptidoglycan,PG）、阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan,AG）、外膜（Outer membrane,OM）和分枝菌酸（Mycolic Acid,MA）。细胞壁则主要由肽聚糖（PG）组成。细胞壁和细胞膜在支持细胞生长,发挥细胞毒力和逃避宿主免疫等方面至关重要。... 

【文章页数】：147 页

【学位级别】：博士

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缩略语表
摘要
ABSTRACT
第1章 综述
    1 结核菌与抗生素耐药
    2 分枝杆菌细胞膜和细胞壁的重要性
    3 细胞壁结构概述
        3.1 细胞被膜生物合成膜结合蛋白的空间定位
        3.2 其他参与膜结合的蛋白
        3.3 脂肪酸合成
    4 分枝杆菌细胞壁组成
        4.1 肽聚糖
        4.2 阿拉伯半乳聚糖生物合成
        4.3 分枝菌酸
    5 分枝杆菌细胞壁靶点
        5.1 细菌信号转导:磷酸化信号分子
        5.2 分枝杆菌STPKs和磷酸酶
        5.3 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和磷酸酶
        5.4 双组分信号系统
    讨论
    参考文献
第2章 绪论
    1 研究目的、选题依据与意义
    2 科学问题
    3 研究内容与技术路线
第3章 吡嗪酰胺耐药基因的筛选和机制研究
    1 实验材料
        1.1 质粒与菌株
        1.2 主要试剂
        1.3 主要溶液及试剂
    2 实验方法
        2.1 感受态的制备
        2.2 吡嗪酰胺敏感菌株筛选
        2.3 质粒拯救法确定突变菌株转座子插入位点
        2.4 提取RNA及分析基因转录
        2.5 构建回补菌株
        2.6 电转耻垢分枝杆菌感受态
        2.7 Western-Blot 检测蛋白表达
        2.8 饥饿胁迫实验
    3 实验结果
        3.1 吡嗪酰胺敏感突变体M492的分离与鉴定
        3.2 M492突变株对抗生素的敏感不是由于生长差异引起的
        3.3 M492 突变株是耻垢分枝杆菌MSMEG_3314 缺失株
        3.4 突变株M492的基因回补菌株的构建
        3.5 MSMEG_3314 基因与结核分枝杆菌EmrB同源性高
        3.6 MSMEG_3314基因缺失可引起氟喹诺酮类药物的杀伤力增强
        3.7 MSMEG_3314基因参与抵抗过氧化氢的杀伤性
        3.8 添加硫脲或2,2′-联吡啶可以抵消或减轻莫西沙星的杀伤力
        3.9 MSMEG_3314基因的缺失与细胞膜通透性改变有关但没有改变细胞壁厚度
        3.10 MSMEG_3314基因缺失增大耻垢分枝杆菌细胞膜电位差
        3.11 RT-PCR发现乙醛酸循环与M492的PZA敏感有关
        3.12 M492突变株的乙醛酸循环速率降低
    4 讨论
    参考文献
第4章 羧酸酯酶CAEA通过分解细胞壁D-ALA-D-ALA导致万古霉素耐受
    1 实验材料
        1.1 质粒与菌株
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 主要溶液及试剂
    2 实验方法
        2.1 同源重组法敲除耻垢分枝杆菌MSMEG_4296基因
        2.2 体外扩增结核分枝杆菌Rv2224c基因片段
        2.3 PCR扩增产物的回收
        2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
        2.5 大肠杆菌的热激法转化
        2.6 TA连接Rv2224c基因片段
        2.7 菌液鉴定PCR
        2.8 提取T-Rv2224c重组质粒
        2.9 构建pALACE-Rv2224c重组质粒
        2.10 制备耻垢分枝杆菌感受态细胞
        2.11 Western Blot验证Rv2224c在耻垢分枝杆菌中的重组蛋白诱导表达
        2.12 蛋白纯化
        2.13 测定生长曲线
        2.14 滑动实验和菌落形态观察
        2.15 重组耻垢分枝杆菌在不同胁迫下的生存能力分析
        2.16 抑菌圈法测定重组耻垢分枝杆菌在SDS和H2O2压力下的抑菌圈直径
        2.17 测定重组耻垢分枝杆菌在联胺条件下的CFU
        2.18 测定重组耻垢分枝杆菌在酸性条件下的CFU
        2.19 重组耻垢分枝杆菌耐药性分析
    3 实验结果
        3.1 Rv2224c基因功能域分析
        3.2 Rv2224c保守性分析
        3.3 耻垢分枝杆菌中MSMEG_4296敲除菌株质粒的构建
        3.4 ΔMSMEG_4296 缺失菌株的筛选和鉴定
        3.5 ΔMSMEG_4296 回补菌株的构建
        3.6 MSMEG_4296敲除不影响生长
        3.7 MSMEG_4296敲除改变分枝杆菌菌落形态
        3.8 MSMEG_4296敲除增强了耻垢分枝杆菌的滑动能力
        3.9 MSMEG_4296敲除减弱了耻垢分枝杆菌生物膜的形成
        3.10 MSMEG_4296敲除能增强万古霉素对耻垢分枝杆菌的杀菌能力
        3.11 Rv2224c过表达能增强耻垢分枝杆菌细胞壁通透性
        3.12 MSMEG_4296敲除能减弱耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活
    讨论
    参考文献
第5章 铜离子对结核分枝杆菌耐受莫西沙星等抗生素至关重要
    1 实验材料
        1.1 质粒与菌株
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 主要试剂和溶液
    2 实验方法
        2.1 培养条件与实验菌株
        2.2 MIC测定
        2.3 抗生素CFU检测
        2.4 耻垢分枝杆菌突变体库的构建
        2.5 测定细菌胞内NADH浓度
        2.6 测定细菌胞内铜离子浓度
    3 实验结果
        3.1构建突变体库,筛选获得在高铜浓度下耐受的突变体X674
        3.2 MSMEG_4702敲除后减弱了耻垢分枝杆菌的生长
        3.3 添加铜离子能恢复MSMEG_4702敲除菌株的生长
        3.4 添加铜离子能恢复MSMEG_4702敲除菌株的生长
        3.5 MSMEG_4702敲除菌株细胞内铜离子浓度下降
        3.6 耻垢分枝杆菌单菌落形态随胞内铜离子浓度而改变
        3.7 MSMEG_4702负责铜离子的摄入而不是其它金属离子
        3.8 敲除 MSMEG_4702增加对铁硫簇合成的保护作用
        3.9 MSMEG_4702的敲除增强耻垢分枝杆菌对莫西沙星的耐受
        3.10 MSMEG_4702的敲除增强巨噬细胞中耻垢分枝杆菌的生存
    讨论
    参考文献
博士期间的学术成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Plant peroxisomal solute transporter proteins[J]. Lennart Charton,Anastasija Plett,Nicole Linka.  Journal of Integrative Plant Biology. 2019(07)



本文编号：3715542