大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因halI/R的克
发布时间：2022-12-10 00:14
蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）是一种杆状革兰氏阴性细菌,为肠杆菌科哈夫尼亚菌属的代表性细菌。因其具有嗜冷、喜好厌氧潮湿环境等特点,常常成为低温贮藏食品中的特定腐败菌（Specific Spoilage Organisms,SSO）。研究表明,其致腐行为受由N-酰基-高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）介导的lux型群体感应系统的调控。因此,本文以腐败大菱鲆中分离纯化得到的一株蜂房哈夫尼亚菌Ha-01为研究对象,通过基因工程和生物信息学等技术研究其菌株内的lux型群体感应调控基因halI/R,初步探究二者编码的HalI/R蛋白的功能性质,并讨论二者能否对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的形成起到调控作用。研究旨在探讨由群体感应系统调节的鱼类腐败机制,为建立以靶向控制群体感应系统为基础的水产品保鲜新技术提供理论依据。1.根据GenBank中登录halI/R基因序列设计特异性扩增全长引物,利用TA克隆技术构建克隆载体pMD-halI和pMD-halR,并导入宿主E.coli JM109中大量扩增;后经测序及BLAST比对分析,结果显示由蜂房哈夫尼亚菌...
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 群体感应现象
1.1.1 群体感应的发现
1.1.2 群体感应的类型
1.2 群体感应相关蛋白及其分子机制
1.2.1 LuxI-type信号分子合成酶
1.2.2 LuxR-type转录因子
1.2.3 LuxR-type转录因子与AHL分子及靶基因的相互作用
1.3 群体感应与水产品腐败
1.3.1 水产品特定腐败菌
1.3.2 水产腐败菌的QS系统
1.3.3 水产品致腐因子与群体感应
1.4 研究的主要内容、目的及意义
第二章 大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因的克隆
2.1 前言
2.2 材料与仪器
2.2.1 实验菌株及培养条件
2.2.2 质粒与引物
2.2.3 主要试剂
2.2.4 主要仪器
2.3 实验方法
2.3.1 菌种活化
2.3.2 蜂房哈夫尼亚菌Ha-01基因组DNA提取
2.3.3 引物设计及合成
2.3.4 蜂房哈夫尼亚菌Ha-01目的基因halI/R的 PCR扩增
2.3.5 琼脂糖凝胶电泳
2.3.6 克隆载体的构建
2.3.7 阳性克隆子的筛选、鉴定与质粒抽提
2.3.8 克隆载体测序及序列比对
2.4 结果与讨论
2.4.1 蜂房哈夫尼亚菌Ha-01目的基因halI/R的PCR扩增与产物纯化
2.4.2 阳性转化子E.coli JM109(pMD-halI,pMD-halR)的筛选
2.4.3 阳性转化子E.coli JM109(pMD-halI,pMD-halR)的鉴定
2.4.4 阳性克隆质粒pMD-halI,pMD-halR的测序结果
2.4.5 目的片段的序列比对结果
2.5 小结
第三章 蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因halI/R的生物信息学分析
3.1 前言
3.2 实验材料与分析工具
3.2.1 halI和halR的核酸序列
3.2.2 生物信息学分析工具
3.3 实验方法
3.3.1 HalI/R蛋白一级结构的确定
3.3.2 HalI/R蛋白的序列比对分析
3.3.3 HalI/R蛋白理化性质的预测
3.3.4 HalI/R蛋白的功能性预测
3.3.5 HalI/R蛋白的二级结构预测
3.3.6 HalI/R蛋白的三维构象预测
3.3.7 蛋白间的相互作用研究
3.3.8 蛋白表达系统的选择
3.4 结果与讨论
3.4.1 HalI/R蛋白一级结构的确定
3.4.2 HalI/R蛋白的BLAST分析
3.4.3 HalI/R蛋白理化性质的预测
3.4.4 HalI/R蛋白功能预测
3.4.5 HalI/R蛋白的二级结构预测
3.4.6 HalI/R蛋白的三维构象模型
3.4.7 蛋白质交互作用研究
3.4.8 halI/R基因密码子偏向性分析
3.5 小结
第四章 蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因halI/R的密码子优化与表达模型构建
4.1 前言
4.2 材料与仪器
4.2.1 实验菌株与质粒
4.2.2 引物
4.2.3 主要试剂
4.2.4 主要仪器
4.3 实验方法
4.3.1 halI/R基因密码子的优化与分析
4.3.2 表达载体的构建
4.3.3 阳性质粒转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)
4.3.4 阳性菌落pET22-halI-BL21、pET28-halR-BL21 的筛选
4.3.5 重组蛋白的诱导表达
4.3.6 重组蛋白表达情况的分析
4.4 结果与讨论
4.4.1 halI/R基因密码子的优化与分析
4.4.2 插入片段的获取
4.4.3 表达质粒的线性化
4.4.4 阳性克隆子的筛选与鉴定
4.4.5 阳性转化子E.coli BL21(DE3)的筛选
4.4.6 目的蛋白的诱导表达
4.4.7 表达情况分析及Western Blotting鉴定
4.5 小结
第五章 蜂房哈夫尼亚菌HalI/R功能的初步研究
5.1 前言
5.2 材料与仪器
5.2.1 实验菌株及培养条件
5.2.2 材料准备
5.2.3 主要试剂
5.2.4 主要仪器
5.3 实验方法
5.3.1 生物感应器菌株检测HalI蛋白合成AHL信号分子的能力
5.3.2 GC-MS分析HalI蛋白所产信号分子的种类
5.3.3 GC-MS分析HalR蛋白结合信号分子的能力
5.3.4 分子对接分析HalR蛋白结合信号分子的作用机理
5.3.5 HalI蛋白合成产物对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的影响
5.4 结果与讨论
5.4.1 HalI蛋白合成AHL信号分子的能力
5.4.2 HalI蛋白合成信号分子的种类
5.4.3 HalR蛋白结合信号分子的能力分析
5.4.4 HalI蛋白合成产物对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的影响
5.5 小结
第六章 总结、创新点及展望
6.1 总结
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
硕士期间发表论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]冷藏草鱼源气单胞菌的群体感应现象及其对生物膜形成的影响[J]. 张彩丽,王辰晨,朱菲菲,刘海梅,刘岩龙. 食品科学. 2019(22)
[2]拟南芥AtOFP8的生物信息学分析及表达分析[J]. 唐尧,张微,尹艳莉,冯鹏,陈宇峰,常缨. 北方园艺. 2018(18)
[3]环境条件对蜂房哈夫尼亚菌群体感应信号分子活性及其形成生物被膜能力的影响[J]. 李婷婷,马艳,崔方超,杨兵,励建荣. 中国食品学报. 2018(04)
[4]群体感应AHLs对温和气单胞菌体外致腐因子分泌的影响[J]. 李婷婷,崔方超,马艳,励建荣. 食品与发酵工业. 2017(03)
[5]不同培养条件及群体感应信号分子对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的影响[J]. 马艳,李婷婷,崔方超,励建荣. 食品科学. 2017(06)
[6]细菌群体感应LuxR solos蛋白研究进展[J]. 叶晓锋,朱军莉,汪海峰. 微生物学报. 2017(03)
[7]大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌群体感应现象及生物被膜调控的研究[J]. 马艳,李婷婷,崔方超,杨兵,刘明爽,励建荣. 现代食品科技. 2016(08)
[8]信号分子N-酰基高丝氨酸内酯分析方法研究进展[J]. 生弘杰,宋洋,卞永荣,柳广霞,刘总堂,蒋新,王芳. 土壤学报. 2016(04)
[9]即食海参优势腐败菌群体感应信号分子识别[J]. 葛静慧,崔玉娜,王晶,张公亮,孙黎明,侯红漫. 中国食品学报. 2015(11)
[10]大菱鲆荧光假单胞菌的群体感应现象及不同碳源培养下的腐败特性研究[J]. 崔方超,李婷婷,刘明爽,马燕,励建荣. 现代食品科技. 2015(12)
博士论文
[1]冷藏凡纳滨对虾特定腐败菌群体感应现象与致腐能力的研究[D]. 朱素芹.中国海洋大学 2015
硕士论文
[1]大黄鱼特定腐败菌S. baltica信号分子与生物胺消长关系及调控[D]. 冯杰.浙江工商大学 2018
[2]大黄鱼腐败希瓦氏菌群体感应信号分子AHLs对其致腐性的影响及机制研究[D]. 张笑笑.浙江工商大学 2017
[3]凡纳滨对虾特定腐败菌中AHLs介导的群体感应与调控的初步研究[D]. 郭红.中国海洋大学 2010
本文编号：3715656
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 群体感应现象
1.1.1 群体感应的发现
1.1.2 群体感应的类型
1.2 群体感应相关蛋白及其分子机制
1.2.1 LuxI-type信号分子合成酶
1.2.2 LuxR-type转录因子
1.2.3 LuxR-type转录因子与AHL分子及靶基因的相互作用
1.3 群体感应与水产品腐败
1.3.1 水产品特定腐败菌
1.3.2 水产腐败菌的QS系统
1.3.3 水产品致腐因子与群体感应
1.4 研究的主要内容、目的及意义
第二章 大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因的克隆
2.1 前言
2.2 材料与仪器
2.2.1 实验菌株及培养条件
2.2.2 质粒与引物
2.2.3 主要试剂
2.2.4 主要仪器
2.3 实验方法
2.3.1 菌种活化
2.3.2 蜂房哈夫尼亚菌Ha-01基因组DNA提取
2.3.3 引物设计及合成
2.3.4 蜂房哈夫尼亚菌Ha-01目的基因halI/R的 PCR扩增
2.3.5 琼脂糖凝胶电泳
2.3.6 克隆载体的构建
2.3.7 阳性克隆子的筛选、鉴定与质粒抽提
2.3.8 克隆载体测序及序列比对
2.4 结果与讨论
2.4.1 蜂房哈夫尼亚菌Ha-01目的基因halI/R的PCR扩增与产物纯化
2.4.2 阳性转化子E.coli JM109(pMD-halI,pMD-halR)的筛选
2.4.3 阳性转化子E.coli JM109(pMD-halI,pMD-halR)的鉴定
2.4.4 阳性克隆质粒pMD-halI,pMD-halR的测序结果
2.4.5 目的片段的序列比对结果
2.5 小结
第三章 蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因halI/R的生物信息学分析
3.1 前言
3.2 实验材料与分析工具
3.2.1 halI和halR的核酸序列
3.2.2 生物信息学分析工具
3.3 实验方法
3.3.1 HalI/R蛋白一级结构的确定
3.3.2 HalI/R蛋白的序列比对分析
3.3.3 HalI/R蛋白理化性质的预测
3.3.4 HalI/R蛋白的功能性预测
3.3.5 HalI/R蛋白的二级结构预测
3.3.6 HalI/R蛋白的三维构象预测
3.3.7 蛋白间的相互作用研究
3.3.8 蛋白表达系统的选择
3.4 结果与讨论
3.4.1 HalI/R蛋白一级结构的确定
3.4.2 HalI/R蛋白的BLAST分析
3.4.3 HalI/R蛋白理化性质的预测
3.4.4 HalI/R蛋白功能预测
3.4.5 HalI/R蛋白的二级结构预测
3.4.6 HalI/R蛋白的三维构象模型
3.4.7 蛋白质交互作用研究
3.4.8 halI/R基因密码子偏向性分析
3.5 小结
第四章 蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因halI/R的密码子优化与表达模型构建
4.1 前言
4.2 材料与仪器
4.2.1 实验菌株与质粒
4.2.2 引物
4.2.3 主要试剂
4.2.4 主要仪器
4.3 实验方法
4.3.1 halI/R基因密码子的优化与分析
4.3.2 表达载体的构建
4.3.3 阳性质粒转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)
4.3.4 阳性菌落pET22-halI-BL21、pET28-halR-BL21 的筛选
4.3.5 重组蛋白的诱导表达
4.3.6 重组蛋白表达情况的分析
4.4 结果与讨论
4.4.1 halI/R基因密码子的优化与分析
4.4.2 插入片段的获取
4.4.3 表达质粒的线性化
4.4.4 阳性克隆子的筛选与鉴定
4.4.5 阳性转化子E.coli BL21(DE3)的筛选
4.4.6 目的蛋白的诱导表达
4.4.7 表达情况分析及Western Blotting鉴定
4.5 小结
第五章 蜂房哈夫尼亚菌HalI/R功能的初步研究
5.1 前言
5.2 材料与仪器
5.2.1 实验菌株及培养条件
5.2.2 材料准备
5.2.3 主要试剂
5.2.4 主要仪器
5.3 实验方法
5.3.1 生物感应器菌株检测HalI蛋白合成AHL信号分子的能力
5.3.2 GC-MS分析HalI蛋白所产信号分子的种类
5.3.3 GC-MS分析HalR蛋白结合信号分子的能力
5.3.4 分子对接分析HalR蛋白结合信号分子的作用机理
5.3.5 HalI蛋白合成产物对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的影响
5.4 结果与讨论
5.4.1 HalI蛋白合成AHL信号分子的能力
5.4.2 HalI蛋白合成信号分子的种类
5.4.3 HalR蛋白结合信号分子的能力分析
5.4.4 HalI蛋白合成产物对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的影响
5.5 小结
第六章 总结、创新点及展望
6.1 总结
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
硕士期间发表论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]冷藏草鱼源气单胞菌的群体感应现象及其对生物膜形成的影响[J]. 张彩丽,王辰晨,朱菲菲,刘海梅,刘岩龙. 食品科学. 2019(22)
[2]拟南芥AtOFP8的生物信息学分析及表达分析[J]. 唐尧,张微,尹艳莉,冯鹏,陈宇峰,常缨. 北方园艺. 2018(18)
[3]环境条件对蜂房哈夫尼亚菌群体感应信号分子活性及其形成生物被膜能力的影响[J]. 李婷婷,马艳,崔方超,杨兵,励建荣. 中国食品学报. 2018(04)
[4]群体感应AHLs对温和气单胞菌体外致腐因子分泌的影响[J]. 李婷婷,崔方超,马艳,励建荣. 食品与发酵工业. 2017(03)
[5]不同培养条件及群体感应信号分子对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的影响[J]. 马艳,李婷婷,崔方超,励建荣. 食品科学. 2017(06)
[6]细菌群体感应LuxR solos蛋白研究进展[J]. 叶晓锋,朱军莉,汪海峰. 微生物学报. 2017(03)
[7]大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌群体感应现象及生物被膜调控的研究[J]. 马艳,李婷婷,崔方超,杨兵,刘明爽,励建荣. 现代食品科技. 2016(08)
[8]信号分子N-酰基高丝氨酸内酯分析方法研究进展[J]. 生弘杰,宋洋,卞永荣,柳广霞,刘总堂,蒋新,王芳. 土壤学报. 2016(04)
[9]即食海参优势腐败菌群体感应信号分子识别[J]. 葛静慧,崔玉娜,王晶,张公亮,孙黎明,侯红漫. 中国食品学报. 2015(11)
[10]大菱鲆荧光假单胞菌的群体感应现象及不同碳源培养下的腐败特性研究[J]. 崔方超,李婷婷,刘明爽,马燕,励建荣. 现代食品科技. 2015(12)
博士论文
[1]冷藏凡纳滨对虾特定腐败菌群体感应现象与致腐能力的研究[D]. 朱素芹.中国海洋大学 2015
硕士论文
[1]大黄鱼特定腐败菌S. baltica信号分子与生物胺消长关系及调控[D]. 冯杰.浙江工商大学 2018
[2]大黄鱼腐败希瓦氏菌群体感应信号分子AHLs对其致腐性的影响及机制研究[D]. 张笑笑.浙江工商大学 2017
[3]凡纳滨对虾特定腐败菌中AHLs介导的群体感应与调控的初步研究[D]. 郭红.中国海洋大学 2010
本文编号：3715656
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3715656.html
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