谷氨酸棒杆菌乳酰谷胱甘肽裂合酶和三磷酸甘油醛脱氢酶基因克

发布时间：2022-12-10 13:45

　　乳酰谷胱甘肽裂合酶（Lac）是降解生物体内丙酮醛的重要酶之一。食品级微生物谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上的NCgl0106预测为乳酰谷胱甘肽裂合酶基因,但尚缺乏实验验证。本试验首先通过PCR技术扩增出预测的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032乳酰谷胱甘肽裂合酶基因lac,并将之与表达载体pET-28a连接,转化BL21（DE3）感受态细胞,成功获得工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-28a-lac。然后,使用IPTG诱导E.coli BL21（DE3）/pET-28a-lac表达重组蛋白乳酰谷胱甘肽裂合酶。SDS-PAGE试验结果表明:重组乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白在大肠杆菌进行了可溶性表达,其分子量约为14kDa。最后,对重组乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白进行了分离纯化、活性检测及酶学特性分析。应用His-tag纯化获得的重组蛋白溶液浓度为604.9μg/mL;活性检测显示重组乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白能催化丙酮醛和谷胱甘肽生成S-D-乳酰谷胱甘肽,表明谷氨酸棒杆菌NCgl0106是乳酰谷胱甘肽裂合酶基因;酶学特性分析表明重组乳酰谷胱甘肽裂合酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为7... 

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 谷氨酸棒杆菌简介
        1.1.1 谷氨酸棒状杆菌的工业应用
        1.1.2 谷氨酸棒状杆菌的全基因组鉴定
    1.2 酶的简介
        1.2.1 乳酰谷胱甘肽裂合酶
        1.2.2 3 -磷酸甘油醛脱氢酶
    1.3 主要研究内容及意义
2 材料和方法
    2.1 菌株,质粒和生长条件及引物
        2.1.1 菌株、质粒和引物
        2.1.2 主要培养基及试剂
        2.1.3 主要试验仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 细菌基因组的制备
        2.2.2 质粒DNA的制备
        2.2.3 PCR反应体系
        2.2.4 质粒和PCR产物的酶切、纯化和连接
        2.2.5 E.coli化学转化法感受态细胞的制备和连接产物的转化
        2.2.6 重组质粒的DNA测序
        2.2.7 蛋白质SDS-PAGE及 Western Blot印迹分析
    2.3 菌种保藏
    2.4 乳酰谷胱甘肽裂合酶基因的克隆与表达
        2.4.1 构建重组质粒pET-28a-lac
        2.4.2 pET-28a-lac重组质粒的转化
        2.4.3 乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白的诱导表达
        2.4.4 化乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白的纯化
        2.4.5 测定纯化蛋白质的浓度及丙酮醛的标准曲线
        2.4.6 测定乳酰谷胱甘肽裂合酶活
    2.5 乳酰谷胱甘肽裂合酶的酶学特征
        2.5.1 测定乳酰谷胱甘肽裂合酶的最适反应pH值
        2.5.2 测定乳酰谷胱甘肽裂合酶的最适反应温度
        2.5.3 金属离子对乳酰谷胱甘肽裂合酶活性的影响
        2.5.4 乳酰谷胱甘肽裂合酶的米氏常数
    2.6 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与表达
        2.6.1 构建重组质粒pET-28a-GAPDH
        2.6.2 pET-28a-GAPDH重组质粒的转化
        2.6.3 3 -磷酸甘油醛脱氢酶蛋白的诱导表达
        2.6.4 3 -磷酸甘油醛脱氢酶蛋白的纯化
        2.6.5 测定纯化蛋白质的浓度
        2.6.6 测定3-磷酸甘油醛脱氢酶酶活
    2.7 测定3-磷酸甘油醛脱氢酶的酶学特征
        2.7.1 测定3-磷酸甘油醛脱氢酶的最适反应pH值
        2.7.2 测定3-磷酸甘油醛脱氢酶的最适反应温度
        2.7.3 测定金属离子对3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的影响
        2.7.4 测定3-磷酸甘油醛脱氢酶的米氏常数
3 结果与分析
    3.1 乳酰谷胱甘肽裂合酶
        3.1.1 PCR扩增乳酰谷胱甘肽裂合酶基因
        3.1.2 pET-28a-lac重组质粒的构建
        3.1.3 乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白浓度及丙酮醛标准曲线测定
        3.1.4 乳酰谷胱甘肽裂合酶的纯化
        3.1.5 不同反应pH值、温度及金属离子对重组乳酰谷胱甘肽裂合酶Lac活性的影响
        3.1.6 乳酰谷胱甘肽裂合酶的米氏常数
    3.2 3-磷酸甘油醛脱氢酶
        3.2.1 PCR扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶基因
        3.2.2 pET-28a-GAPDH重组质粒的构建
        3.2.3 3-磷酸甘油醛脱氢酶的纯化
        3.2.4 3-磷酸甘油醛脱氢酶浓度测定
        3.2.5 不同反应pH值、温度及金属离子对重组乳酰谷胱甘肽裂合酶Lac活性的影响
        3.2.6 3-磷酸甘油醛脱氢酶的米氏常数
4 讨论和结论
参考文献
作者简历
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]辣椒3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CaGAPB的克隆及表达分析[J]. 李严曼,欧阳孟真,孙守如,朱磊.  分子植物育种. 2018(05)
[2]乙二醛酶1在脑胶质瘤组织中的表达[J]. 李锦宏,陈兵,顾雪锋,马国达,杨帆,高力扬,廖壮槟,林亨,龙霄翱.  广东医学院学报. 2016(05)
[3]代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生成丙酮酸[J]. 于莹,许湄雪,刘金雷,范荣,冯惠勇,李天明.  生物技术通报. 2016(08)
[4]3-磷酸甘油醛脱氢酶在细菌粘附中的作用及机制[J]. 刘丽,章文明,王翀,汪海峰.  微生物学报. 2016(09)
[5]谷胱甘肽双功能合成酶的克隆表达、酶学性质及其应用的研究[J]. 陈斌斌,杨修亮,杭宝建,石礼涛,黄磊,蔡谨,徐志南.  药物生物技术. 2015(05)
[6]乙二醛酶Ⅰ基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系[J]. 廖志敏,符家武,刘根.  中华神经科杂志. 2015 (07)
[7]谷氨酸棒杆菌生产L赖氨酸的培养优化和产酸特性研究[J]. 苏会波,林海龙,罗虎,周勇,卢宗梅.  食品工业科技. 2014(17)
[8]利用蛋白质序列模式识别改善谷氨酸棒杆菌基因组注释[J]. 周大为,李炜疆.  工业微生物. 2014(03)
[9]白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达[J]. 赵珊梅,袁雪岩,石建峰,李昂,苗群爱.  北京口腔医学. 2013(05)
[10]3-磷酸甘油醛脱氢酶的分子生物学功能及其对寄生虫防治的研究进展[J]. 方政.  国外医学(医学地理分册). 2013 (02)

硕士论文
[1]乙二醛酶I基因Ala111Glu多态性与糖尿病合并冠心病的关系以及人血浆丙酮醛的高效液相色谱测定方法的建立[D]. 金勋.中国协和医科大学 2008



本文编号：3716855