转基因棉花MON531 R7569 中截短cry1Ac基因表达的初步分析

发布时间：2023-02-19 14:46

　　转基因抗虫棉是目前我国种植面积最大的转基因作物。美国孟山都公司研发的一代抗虫棉MON531转化体已在我国批准商业化种植和应用超过20年。MON531^R7569是本实验室发现的与MON531转化体具有相同旁侧序列但cry1Ac基因发生截短的转基因棉花材料。本研究验证了MON531^R7569的分子结构,建立了其检测方法,分析了截短cry1Ac基因的转录及蛋白表达水平,初步分析了cry1Ac基因的甲基化情况,主要结果有以下五个方面:1:采用PCR方法验证了MON531^R7569的外源整合结构,并建立了MON531^R7569的特异性定量PCR检测方法。结果表明:MON531^R7569的转基因整合结构与MON531整合结构相同,但cry1Ac基因3,端序列及终止子区域发生缺失。基于cry1Ac基因重组区域建立了定量检测方法,对476份市场转基因棉花的定量分析表明:有4份样品检出MON531^R7569,含量最高为1.56%。2:利用RACE和RT-PCR方法分析了MO...

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【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 转基因作物发展现状
        1.1.1 全球转基因作物发展现状
        1.1.2 我国转基因棉花发展现状
    1.2 转基因生物监管及标识制度
    1.3 转基因作物检测技术发展
        1.3.1 转基因作物外源核酸的PCR检测技术
            1.3.1.1 转基因外源核酸PCR检测技术的发展
            1.3.1.2 常用的转基因PCR检测技术
        1.3.2 转基因作物外源蛋白检测技术及其他检测技术
    1.4 转基因整合特点
    1.5 转基因植物分子特征
    1.6 转基因作物中杀虫蛋白的表达及其影响因素
        1.6.1 转基因棉花杀虫基因表达的研究
        1.6.2 其他转基因作物中抗虫基因的表达研究
        1.6.3 影响转基因作物外源蛋白表达的因素
    1.7 研究背景、内容及意义
        1.7.1 研究背景
        1.7.2 研究内容
        1.7.3 研究意义
第二章 MON531^R7569插入结构验证及检测方法的建立
    2.1 实验试剂及仪器
    2.2 样品制备
        2.2.1 材料来源
        2.2.2 基因组DNA提取
    2.3 引物设计
        2.3.1 结构验证引物设计
        2.3.2 外源整合结构验证引物设计
        2.3.3 定量检测方法的引物设计
    2.4 PCR扩增
        2.4.1 MON531^R7569的旁侧序列及cry1Ac基因的扩增
        2.4.2 MON531^R7569的外源插入结构的扩增
        2.4.3 定量PCR
            2.4.3.1 定量标准曲线的建立
            2.4.3.2 定量PCR扩增
            2.4.3.3 MON531^R7569市场样品的定量检测
    2.5 结果与分析
        2.5.1 MON531^R7569中旁侧序列和cry1Ac基因验证结果
        2.5.2 MON531^R7569外源插入结构的验证
        2.5.3 定量检测方法的建立及应用
            2.5.3.1 定量PCR方法的建立
            2.5.3.2 市场样品的定量检测
    2.6 讨论与分析
第三章 MON531^R7569中cry1Ac基因的转录分析
    3.1 主要试剂及仪器
    3.2 样品制备及RNA提取
        3.2.1 材料来源
        3.2.2 总RNA提取
    3.3 RACE分析
        3.3.1 RACE引物设计
        3.3.2 RACEReadycDNA的合成
        3.3.3 巢式PCR扩增
        3.3.4 PCR产物克隆测序
            3.3.4.1 产物回收
            3.3.4.2 连接载体并转化感受态细胞
            3.3.4.3 配置LB液体和固态平板培养基
            3.3.4.4 涂板及扩繁
            3.3.4.5 菌液PCR鉴定及测序
    3.4 RT-PCR
        3.4.1 RT-PCR引物设计
        3.4.2 cDNA的合成
        3.4.3 标准曲线的建立
        3.4.4 RT-PCR
        3.4.5 RT-PCR数据处理
    3.5 结果分析
        3.5.1 MON531^R7569的cry1Ac基因的转录本分析
            3.5.1.1 巢式PCR
            3.5.1.2 PCR产物克隆测序
            3.5.1.3 cry1Ac基因的转录本分析
        3.5.2 MON531^R7569的cry1Ac基因转录分析
            3.5.2.1 cry1Ac基因的标准曲线
            3.5.2.2 转录水平分析
    3.6 结论与讨论
第四章 MON531^R7569中Cry1Ac蛋白的表达分析
    4.1 实验试剂与仪器
    4.2 样品制备
        4.2.1 材料来源
        4.2.2 植物总蛋白的提取
    4.3 Cry1Ac蛋白含量测定
    4.4 数据统计数据分析
    4.5 结果分析
    4.6 结论与讨论
第五章 转基因棉花MON531^R7569室内抗虫性测定
    5.1 实验试剂及仪器
    5.2 材料准备
        5.2.1 棉花样品来源
        5.2.2 供试虫源
    5.3 生物测定
    5.4 杀虫蛋白含量测定
    5.5 数据处理
    5.6 结果分析
        5.6.1 棉铃虫取食棉花叶片情况
        5.6.2 转基因抗虫棉抗虫性测定
        5.6.3 Cry1Ac杀虫蛋白含量测定
    5.7 结论与讨论
第六章 cry1Ac基因序列的甲基化分析
    6.1 主要试剂及仪器
    6.2 样品制备
        6.2.1 材料来源
        6.2.2 基因组DNA提取
    6.3 引物设计
        6.3.1 MON531^R7569的cry1Ac基因MSRE-qPCR引物设计
        6.3.2 亚硫酸盐测序法的PCR引物设计
    6.4 cry1Ac基因的MSRE-qPCR
        6.4.1 甲基化敏感的限制性内切酶的选择
        6.4.2 酶切基因组DNA
        6.4.3 RT-PCR
    6.5 亚硫酸盐测序分析甲基化区域
        6.5.1 基因组DNA的亚硫酸盐处理
        6.5.2 PCR扩增
        6.5.3 产物克隆测序
    6.6 数据处理
        6.6.1 cry1Ac基因甲基化区域定量分析
    6.7 结果分析
        6.7.1 MON531^R7569的cry1Ac基因的甲基化测定
        6.7.2 cry1Ac基因序列甲基化区域不同时期的监测
        6.7.3 cry1Ac基因甲基化序列区域亚硫酸盐测序
    6.8 结论与讨论
第七章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历



本文编号：3746418