球孢白僵菌细胞表面蛋白基因Bbcsp1(BBA 0 9174)的功能研究与分析

发布时间：2023-04-04 01:18

　　球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一类广泛分布于自然界的重要昆虫病原真菌,其宿主范围十分广泛,它不仅能引起野外昆虫的感染及疾病流行,其中一些菌株还是家蚕的重要病原菌。家蚕的体壁表皮是阻碍病原真菌侵染的第一道天然屏障,对免疫防御病原菌的入侵具有重要作用,在球孢白僵菌粘附在家蚕体壁和穿透表皮的过程中,蚕体会发生一系列的生理、病理及免疫反应,球孢白僵菌侵染相关基因也会对此作出相应的特异性应答。因此,寻找和鉴定球孢白僵菌此过程涉及的相关基因及其功能不仅对进一步揭示球孢白僵菌的致病机制具有重要意义,同时也能为寻找新的防治家蚕白僵病的策略奠定基础。家蚕球孢白僵菌菌株(GXsk1011)是本实验室从家蚕中分离鉴定出的一株高毒力菌株,在本实验室前期研究中发现,该菌株在应答3种不同昆虫表皮的过程中,一个被转录组学分析注释为球孢白僵菌细胞表面蛋白的基因Bbcsp1(BBA＿09174)于应答棉铃虫和豆青虫表皮相比,在对家蚕表皮的应答时均表现为显著上调表达。该类蛋白与研究报道较多的球孢白僵菌细胞壁蛋白有所区别,其结构和功能都鲜有报道。本研究以该蛋白基因为试验对象,进行了基因的克隆及生物信息...

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
    1.1 昆虫病原真菌及球孢白僵菌概述
        1.1.1 昆虫病原真菌概况
        1.1.2 球孢白僵菌简介
        1.1.3 球孢白僵菌的研究意义
        1.1.4 球孢白僵菌基因功能研究的主要方法
    1.2 球孢白僵菌致病机理与毒力因子
        1.2.1 致病机制
        1.2.2 致病过程
        1.2.3 致病因子
    1.3 细胞表面蛋白
        1.3.1 细胞表面
        1.3.2 细胞壁蛋白
        1.3.3 质膜表面蛋白
第2章 引言
    2.1 研究背景和意义
    2.2 研究依据和目的
    2.3 研究内容
        2.3.1 Bbcsp1生物信息学分析
        2.3.2 Bbcsp1基因敲除
        2.3.3 Bbcsp1超量表达
        2.3.4 Bbcsp1对生物学表型和毒力的影响
    2.4 研究路线
第3章 球孢白僵菌Bbcsp1基因的克隆及其生物信息学分析
    3.1 实验材料与方法
        3.1.1 实验菌株
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 试剂和培养基配制
        3.1.4 实验仪器
        3.1.5 实验分析所涉及的网站及网址
    3.2 实验方法
        3.2.1 球孢白僵菌基因组DNA的提取
        3.2.2 获得目的基因序列
        3.2.3 生物信息学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 Bbcsp1基因的克隆
        3.3.2 Bbcsp1基因的同源性分析
        3.3.3 Bbcsp1基因的氨基酸序列分析
        3.3.4 Bbcsp1蛋白结构域
    3.4 本章小结
第4章 Bbcsp1基因敲除与超量表达菌株的构建
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株与载体
        4.1.2 工具酶和试剂
        4.1.3 主要试剂和培养基配方
        4.1.4 主要仪器
    4.2 敲除载体的构建
        4.2.1 基因上下游片段的克隆
        4.2.2 基因上游片段与敲除载体骨架连接
        4.2.3 基因下游片段与敲除载体骨架连接
    4.3 超量表达载体的构建
        4.3.1 强启动子g3pd和 Bbcsp1-orf片段的克隆
        4.3.2 两基因片段与超量表达骨架载体连接
    4.4 农杆菌转化球孢白僵菌
        4.4.1 基因敲除载体和超量表达载体转化农杆菌
        4.4.2 介导转化球孢白僵菌
        4.4.3 转化子的初步筛选
    4.5 获得敲除突变株
        4.5.1 转化子的PCR筛选
        4.5.2 转化子的RT-PCR验证
    4.6 获得超量表达突变株
        4.6.1 转化子PCR和 PT-PCR检验
        4.6.2 转化子q PT-PCR检测
    4.7 实验结果
        4.7.1 侧翼序列的克隆
        4.7.2 敲除载体的构建与验证
        4.7.3 强启动子和Bbcsp1-orf的克隆
        4.7.4 超量表达载体的构建与验证
        4.7.5 敲除突变株的验证
        4.7.6 超量表达突变株的验证
    4.8 小结与讨论
第5章 Bbcsp1突变株与野生株生物学表型和毒力的比较
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验菌株及试验昆虫
        5.1.2 实验试剂和培养基
    5.2 实验方法
        5.2.1 菌落表型差异观察及生长速度测定
        5.2.2 分生孢子萌发率(孢子活力)测定
        5.2.3 不同化学胁迫因子对生长的影响分析
        5.2.4 湿热对生长的影响分析
        5.2.5 毒力测定
    5.3 结果与分析
        5.3.1 Bbcsp1基因对菌落形态和生长速率的影响
        5.3.2 Bbcsp1基因对分生孢子活性的影响
        5.3.3 Bbcsp1基因对抗逆境反应的影响
        5.3.4 Bbcsp1基因对抗湿热反应的影响
        5.3.5 Bbcsp1基因对白僵菌毒力的影响
    5.4 本章小结
第6章 全文总结与讨论
参考文献
附录
致谢
发表论文及参加的科研项目



本文编号：3781509