烟草腺毛特异高表达乙酰乳酸合酶基因在糖酯合成中的功能鉴定

发布时间：2023-04-19 19:02

　　茄科糖酯(又称酰基糖)在腺毛中特异合成,其不但具有抑菌、抗虫、抗微生物、抗氧化等多种生物功能,而且在烟草中也是重要香气前体物,对烟草香气品质具有重要贡献,因此,挖掘鉴定糖酯合成基因,揭示糖酯合成调控分子机制,对以提高糖酯含量为重要育种目标的茄科作物育种以及糖酯的生物合成利用,均具有重要意义。近年来,有关茄科糖酯合成过程中酰基链与糖环的组装及其关键调控基因的研究,在番茄和矮牵牛中已经取得较大进展。关于酰基链的形成机制,以往研究认为是通过支链氨基酸合成途径合成,但目前鉴定获得的关键调控基因还较少。本研究基于同源比对分析,挖掘支链氨基酸合成代谢的关键调控基因乙酰乳酸合酶基因3个,结合烟草腺毛和叶片转录组测序数据以及组织表达模式分析,发现其中一个乙酰乳酸合酶基因(定名NtALS1)在腺毛特异表达,推测其可能参与烟草糖酯合成。本研究通过组织定位、亚细胞定位和CRISPR Cas9敲除技术,对该基因进行了系统的功能鉴定。研究结果表明,NtALS1在腺毛腺头细胞的叶绿体中特异表达,是烟草糖酯合成代谢的一个关键基因。主要研究结果如下:1.从茄科基因组网的K326基因组中搜索到3个ALS大亚基的同源基因...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 茄科糖酯的相关研究
        1.1.1 糖酯的功能特性
        1.1.2 糖酯的主要结构类型
        1.1.3 糖酯合成代谢机制
    1.2 乙酰乳酸合酶相关研究进展
        1.2.1 乙酰乳酸合酶的发现
        1.2.2 高等植物中的乙酰乳酸合酶
    1.3 基因功能鉴定方法
        1.3.1 生物信息学分析
        1.3.2 转基因技术
        1.3.3 表达模式分析
        1.3.4 基因编辑技术
    1.4 本研究切入点与技术路线
        1.4.1 切入点
        1.4.2 技术路线
第二章 NtALS候选基因的挖掘
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 载体和菌种
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 实验仪器
        2.1.5 数据分析
    2.2 实验方法
        2.2.1 候选基因的筛选与系统进化树的构建
        2.2.2 引物设计
        2.2.3 q RT-PCR方法
        2.2.4 基因克隆方法
    2.3 结果与分析
        2.3.1 普通烟草中ALS候选基因的筛选
        2.3.2 Nt ALSs的系统进化树分析
        2.3.3 NtALS1的克隆与遗传来源分析
    2.4 讨论
第三章 NtALS1的组织定位分析
    3.1 材料与试剂
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 载体和菌种
        3.1.3 实验试剂
        3.1.4 实验仪器
        3.1.5 数据分析
    3.2 实验方法
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 NtALS1启动子的克隆
        3.2.3 组织定位表达载体的构建
        3.2.4 激光共聚焦观察
    3.3 结果与分析
        3.3.1 启动子的克隆
        3.3.2 构建组织定位载体
        3.3.3 瞬时表达结果
    3.4 讨论
第四章 NtALS1的亚细胞定位分析
    4.1 材料与试剂
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 载体和菌种
        4.1.3 实验试剂
        4.1.4 实验仪器
        4.1.5 数据分析
    4.2 实验方法
        4.2.1 亚细胞定位的预测
        4.2.2 引物设计
        4.2.3 亚细胞定位载体的构建
        4.2.4 激光共聚焦观察
    4.3 结果与分析
        4.3.1 NtALS1亚细胞定位的预测
        4.3.2制备p2#4线性载体
        4.3.3 亚细胞定位载体构建
        4.3.4 瞬时表达结果
    4.4 讨论
第五章 NtALS1的基因敲除分析
    5.1 材料与试剂
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 载体和菌种
        5.1.3 实验试剂
        5.1.4 实验仪器
        5.1.5 数据分析
    5.2 实验方法
        5.2.1 靶标序列的设计
        5.2.2 构建中间载体
        5.2.3 构建三元靶标重组载体
        5.2.4 遗传转化与组织培养
        5.2.5 突变体鉴定
        5.2.6 鲜烟叶表面糖酯检测
    5.3 结果与分析
        5.3.1 Crispr Cas9 载体构建及遗传转化
        5.3.2 T0代突变体的分子检测
        5.3.3 T1代纯合突变体的分子检测
        5.3.4 T1代纯合突变体糖酯表型的鉴定
    5.4 讨论
第六章 全文结论
参考文献
附录A
致谢
作者简历



本文编号：3794036