靶向MSTN基因shRNA表达载体的构建及其体内干扰研究

发布时间：2023-04-20 20:46

　　肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),又名抑肌素、生长分化因子8(GDF-8),属于TGF-β超家族,其功能主要是作为一种骨骼肌生长的负调控因子,限制肌肉超常发育。该基因的缺失或突变会使肌细胞增生和肥大,机体表现为双肌性状。近年来,研究发现MSTN不仅可调控肌肉生长发育,在肌肉稳态中起关键作用,而且还影响脂肪形成和骨骼发育,并与胰岛素敏感性有关。对MSTN基因的深入研究在畜牧业及医学领域具有重要意义。因此,有关MSTN基因与多种疾病的关系及其在机体代谢中的作用受到广泛关注。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。该技术可以简便、快速、高效、特异性的抑制基因的表达,因此受到了各个领域研究人员的重视。本文拟构建靶向MSTN基因的pSIREN-MSTN-shRNA表达载体,并使用不同的体内转染方法转染小鼠并比较其体内干扰效果,为后续开展相应的MSTN基因功能研究奠定工作基础。本文首先根据MSTN基因的mRNA序列设计siRNA,并挑选出3条可能具有良好干扰效果的siRNA...

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 肌肉生长抑制素概述
        1.1.1 肌肉生长抑制素的结构及分布
        1.1.2 肌肉生长抑制素的作用机制
        1.1.3 肌肉生长抑制素研究进展
    1.2 RNA干扰
    1.3 基因载体
        1.3.1 基因治疗载体概述
        1.3.2 阳离子聚合物PEI
        1.3.3 脂质体
    1.4 本课题的研究目的及意义
第二章 MSTN基因shRNA表达载体的构建与初步筛选
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 实验试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 MSTN shRNA序列的设计与合成
        2.2.2 pSIREN-MSTN-shRNA表达载体的构建
        2.2.3 重组干扰质粒的提取
        2.2.4 shRNA表达载体导入小鼠体内
        2.2.5 荧光定量PCR
        2.2.6 Western blot实验
        2.2.7 统计学分析
    2.3 结果
        2.3.1 pSIREN-DNR-DsRed-Express载体的酶切
        2.3.2 pSIREN-MSTN-shRNA表达载体的鉴定
        2.3.3 质粒提取质量鉴定
        2.3.4 shRNA干扰后MSTN的 mRNA表达水平检测
        2.3.5 Western blot检测干扰后MSTN的蛋白质表达
    2.4 讨论
第三章 肌肉注射法介导的小鼠体内干扰实验
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物
        3.1.2 实验试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 pSIREN-MSTN重组干扰质粒的大量提取及纯化
        3.2.2 小鼠肌肉注射
        3.2.3 免疫印迹分析(Western blot,WB)
        3.2.4 肌肉组织HE染色
        3.2.5 统计学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 质粒提取结果
        3.3.2 干扰后小鼠的体重结果
        3.3.3 Western blot检测MSTN的蛋白质表达
        3.3.4 HE染色检测肌纤维状态
    3.4 讨论
第四章 PEI/shRNA复合物介导的小鼠体内干扰实验研究
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验动物
        4.1.2 实验试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 pSIREN-MSTN重组干扰质粒的大量提取及纯化
        4.2.2 PEI/质粒DNA复合物的形成
        4.2.3 PEI/pSIREN-MSTN体内转染
        4.2.4 Western印迹
        4.2.5 肌肉组织切片及HE染色
        4.2.6 统计学分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 质粒浓度与纯度测定
        4.3.2 干扰后小鼠的体重结果
        4.3.3 Western blot检测MSTN的蛋白质表达
        4.3.4 HE染色检测肌纤维状态
    4.4 讨论
第五章 卵磷脂-胆固醇脂质体介导的小鼠体内干扰实验
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验动物
        5.1.2 实验试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 pSIREN-MSTN重组干扰质粒的大量提取及纯化
        5.2.2 卵磷脂-胆固醇脂质体的制备
        5.2.3 脂质体包裹的质粒pSIREN-MSTN体内转染
        5.2.4 Western印迹
        5.2.5 肌肉组织切片及HE染色
        5.2.6 统计学分析
    5.3 实验结果
        5.3.1 干扰后小鼠的体重结果
        5.3.2 Western blot检测MSTN的蛋白质表达
        5.3.3 HE染色检测肌纤维状态
    5.4 讨论
参考文献
附录1 实验主要仪器设备
附录2 主要试剂配方
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
个人简况及联系方式



本文编号：3795260