基于转录组的水稻潜根线虫β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及功能分析

发布时间：2023-04-21 02:40

　　植物寄生线虫是危害水稻的重要病原物之一,给水稻产量带来重大损失。在侵染寄主植物的过程中,线虫通过分泌细胞壁降解酶来软化降解植物细胞壁协助侵染,完成寄生。在线虫分泌的细胞壁降解酶中,β-1,4-内切葡聚糖酶是目前研究最多的一种。β-1,4-内切葡聚糖酶能够水解植物细胞壁中的1,4糖苷键,破坏纤维素的结构,最终降解植物细胞壁。为研究尖细潜根线虫(Hirschmanniella mucronata)β-1,4-内切葡聚糖酶基因(Hm-eng-1)在侵染过程中的生物学功能,本实验的工作内容作如下安排:1.尖细潜根线虫转录组数据的分析:通过分析侵染抗病水稻RN51的线虫、侵染感病水稻RN155的线虫和未侵染任何水稻的线虫NHP的转录组数据,当RPKM>0.3时,样本中约有143000个基因表达,约82.3%的线虫基因组编码基因。其中参与柠檬酸循环(TCA),糖酵解途径(EMP)的基因,RNA转运相关基因,氨基酸合成基因,脂肪酸代谢相关基因和细胞壁降解酶基因的表达发生显著性上调。这表明线虫在侵染水稻时,其代谢水平的提高能够为成功侵染寄主提供物质基础。2.Hm-eng-1基因的克隆和序列分析:...

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 潜根线虫的概述
        1.1.1 潜根线虫的生物学特性
        1.1.2 潜根线虫及其危害
    1.2 植物寄生线虫效应子在线虫寄生过程中的重要作用
        1.2.1 降解或修饰植物细胞壁
        1.2.2 调节植物免疫防御
        1.2.3 调控植物细胞发育
    1.3 植物寄生线虫效应子的定位研究
        1.3.1 食道腺细胞
        1.3.2 头感器
        1.3.3 皮下组织
        1.3.4 其他
    1.4 线虫β-1,4-内切葡聚糖酶的研究进展
        1.4.1 eng及其序列特征
        1.4.2 β-1,4-内切葡聚糖酶的蛋白序列特征
        1.4.3 eng基因表达分析
    1.5 本研究的目的及内容
        1.5.1 课题来源
        1.5.2 研究目的
        1.5.3 研究内容
        1.5.4 研究技术路线
第二章 尖细潜根线虫的转录组数据分析
    2.1 材料
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 转录组数据
    2.2 方法
        2.2.1 测序数据质量分析
        2.2.2 参考序列(ref)比对
        2.2.3 基因表达水平统计分析
        2.2.4 差异表达基因(DEG)的分析
        2.2.5 差异基因GO富集分析
        2.2.6 差异基因KEGG富集分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 测序数据质量结果
        2.3.2 ref比对结果
        2.3.3 基因表达水平
        2.3.4 DEGs统计
        2.3.5 差异基因GO富集分析
        2.3.6 差异基因KEGG富集分析
    2.4 小结与讨论
第三章 尖细潜根线虫Hm-eng-1基因的克隆与序列分析
    3.1 材料
        3.1.1 载体及菌株
        3.1.2 引物
    3.2 方法
        3.2.1 潜根线虫的收集
        3.2.2 潜根线虫总RNA的提取
        3.2.3 cDNA第一条链的合成
        3.2.4 Hm-eng-1基因cDNA全长的扩增
            3.2.4.1 第一次PCR
            3.2.4.2 第二次PCR
        3.2.5 克隆测序
            3.2.5.1 PCR产物回收纯化
            3.2.5.2 连接产物的转化
            3.2.5.3 单菌落PCR筛选阳性克隆
            3.2.5.4 测序与保种
    3.3 结果与分析
        3.3.1 RNA提取结果
        3.3.2 Hm-eng-1基因的扩增
        3.3.3 Hm-eng-1基因克隆载体阳性鉴定
        3.3.4 Hm-eng-1基因的序列分析
        3.3.5 ENG蛋白的系谱分析
    3.4 小结与讨论
第四章 尖细潜根线虫Hm-eng-1基因的表达定位研究
    4.1 材料
        4.1.1 引物
    4.2 方法
        4.2.1 潜根线虫的收集
        4.2.2 探针合成
            4.2.2.1 重组质粒的提取
            4.2.2.2 第一轮PCR
            4.2.2.3 PCR产物回收纯化
            4.2.2.4 第二轮PCR
        4.2.3 原位杂交
            4.2.3.1 线虫的固定
            4.2.3.2 杂交前处理
            4.2.3.3 预杂交、杂交
            4.2.3.4 杂交后处理
            4.2.3.5 显色与观察
    4.3 结果与分析
        4.3.1 探针合成
        4.3.2 原位杂交结果
    4.4 小结与讨论
第五章 尖细潜根线虫Hm-eng-1基因的原核表达
    5.1 材料
        5.1.1 载体及菌株
        5.1.2 引物
    5.2 方法
        5.2.1 表达载体的构建
            5.2.1.1 提取重组质粒
            5.2.1.2 Hm-eng-1基因的PCR扩增
            5.2.1.3 PCR产物回收纯化
            5.2.1.4 目的片段与原核表达载体连接与转化
            5.2.1.5 单菌落PCR筛选阳性克隆
            5.2.1.6 测序与保种
        5.2.2 Hm-eng-1基因的表达
            5.2.2.1 提取重组表达载体质粒
            5.2.2.2 转化感受态细胞
            5.2.2.3 Hm-eng-1基因的诱导表达
        5.2.3 SDS-PAGE蛋白电泳
            5.2.3.1 制胶
            5.2.3.2 上样
            5.2.3.3 电泳
            5.2.3.4 染色、脱色
            5.2.3.5 检测
        5.2.4 重组蛋白的Westernblot
            5.2.4.1 SDS-PAGE电泳
            5.2.4.2 转膜
            5.2.4.3 封闭
            5.2.4.4 抗体孵育
            5.2.4.5 发光液显色
            5.2.4.6 检测与保存
    5.3 结果分析
        5.3.1 原核表达载体构建pEASY-BluntE1-Hm-eng-1的构建
        5.3.2 重组表达载体的诱导表达
    5.4 结论与讨论
第六章 RNAi技术分析尖细潜根线虫Hm-eng-1基因功能
    6.1 材料
        6.1.1 载体及菌株
        6.1.2 引物
    6.2 方法
        6.2.1 入门载体的构建
            6.2.1.1 提取重组质粒、pGWC入门载体质粒
            6.2.1.2 Hm-eng-1基因的PCR扩增
            6.2.1.3 pGWC入门载体的酶切
            6.2.1.4 PCR产物与酶切产物回收纯化
            6.2.1.5 目的片段与入门载体连接与转化
            6.2.1.6 单菌落PCR筛选阳性克隆
            6.2.1.7 测序与保种
        6.2.2 RNAi载体的构建
            6.2.2.1 提取pB7G干扰载体质粒
            6.2.2.2 LR反应构建RNAi载体
            6.2.2.3 单菌落PCR筛选阳性克隆
            6.2.2.4 测序与保种
        6.2.3 农杆菌转染水稻
            6.2.3.1 制备感受态农杆菌GV3101
            6.2.3.2 冻融法转化农杆菌及阳性转化检测
            6.2.3.3 农杆菌介导转染水稻
            6.2.3.4 转基因水稻植株的鉴定
    6.3 结果分析
        6.3.1 RNAi载体的构建
        6.3.2 重组干扰载体pB7G-Hm-eng-1转化GV3101
        6.3.3 PCR法检测转基因水稻植株
        6.3.4 快速试纸条法检测转基因水稻植株
    6.4 结论与讨论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3795670