青鳉（Oryzias latipes）sox3基因的克

发布时间：2023-05-13 12:52

　　sox基因家族是一系列与雄性哺乳动物Y染色体上性别决定基因sry(sex determination region of Y chromosome)高度同源的基因的统称。迄今为止,在不同物种中已经发现了40余种sox基因,不同的sox基因在生物体中各自承担着重要的调控角色,包括动物的性别决定与分化过程、早期胚胎发育、早期神经系统的发育、软骨发育以及多种组织器官的形成。sox3是唯一一个定位在X染色体上的sox基因,不仅如此,sox3还是sox基因家族中与哺乳动物雄性性别决定基因sry同源性最高的一个,因此吸引着众多研究者的目光。在小鼠中sox3被证实与性腺发育息息相关,与配子发生有着紧密的联系,在鱼类中sox3被证实与生殖细胞的发育有关,在恒河青鳉中是重要的雄性性别决定基因。但是诸多研究中sox3都没有一个准确的表达模式。因此,发现和确定sox3基因的表达模式对进一步研究其功能是十分必要的。青鳉是小型淡水鱼,其个体小、胚胎透明、繁殖快、基因组小,是研究发育生物学和细胞生物学优秀的模式物种。青鳉是第一个发现雄性性别决定dmy基因的非哺乳动物,也是唯一一个拥有雌性性别决定基因foxl3的脊...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.鱼类性别决定相关基因的研究
        1.1 芳香化酶基因
        1.2 sox基因家族
        1.3 dmrt1 基因
        1.4 amh基因
        1.5 其他相关基因
    2.sox基因家族相关研究的概述
        2.1 sox基因家族及其分类
        2.2 sox基因的特点
            2.2.1 进化的保守性
            2.2.2 含有较少的内含子
            2.2.3 分散存在于基因中
            2.2.4 网络调控系统
            2.2.5 功能的多样性
        2.3 sox基因的功能
            2.3.1 早期胚胎发育
            2.3.2 性别决定和性别分化
            2.3.3 神经系统发育
            2.3.4 软骨形成、血的形成和晶状体发育
    3、sox3 基因的研究进展
        3.1 sox3 与性腺的发育
        3.2 sox3 与中枢神经系统的发育
        3.3 sox3 与下丘脑-垂体轴的形成
    4.miRNA-mRNA作用机制和研究方法
        4.1 miRNA的形成及作用机制
        4.2 与sox3 相互结合的miRNA基因预测和验证
    5、本研究的目的和意义
第二章 青鳉sox3 基因克隆及表达模式分析
    1.实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验试剂
        1.3 仪器
    2.实验方法
        2.1 总RNA的提取
        2.2 RNA反转录为cDNA
        2.3 引物设计
        2.4 RT-PCR扩增
        2.5 PCR产物回收
        2.6 PCR产物连接
        2.7 感受态大肠杆菌制备
        2.8 转化
        2.9 质粒小提
        2.10 序列比对、系统发育和染色体位置分析
        2.11 原位杂交
            2.11.1 探针体外合成
            2.11.2 冰冻切片
            2.11.3 化学原位杂交
            2.11.4 胚胎化学原位杂交
            2.11.5 双色荧光原位杂交
    3.结果
        3.1 RNA质量检测
        3.2 sox3 基因编码区的鉴定
        3.3 青鳉sox3 序列分析
            3.3.1 多序列比对分析
            3.3.2 同源性分析
            3.3.3 系统发育分析
            3.3.4 染色体线性关系分析
        3.4 RT-PCR分析sox3 在青鳉成鱼组织和胚胎中的表达
        3.5 化学原位杂交检测sox3 RNA在青鳉性腺中的时空表达
        3.6 荧光双色原位杂交对sox3 在卵巢中进行亚细胞定位
        3.7 荧光双色原位杂交对sox3 在精巢中进行亚细胞定位
        3.8 整体胚胎化学原位杂交探究sox3 在胚胎发育过程中的表达
    4.讨论
        4.1 生物信息学分析
        4.2 RT-PCR分析
        4.3 sox3 在青鳉卵巢的表达
        4.4 sox3 在青鳉精巢中的表达
        4.5 sox3 在青鳉胚胎中的表达
第三章 以青鳉sox3为靶基因的miRNA初步验证
    1.实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验试剂
        1.3 实验仪器
    2.实验方法
        2.1 质粒构建
            2.1.1 目的片段获取
            2.1.2 重组质粒骨架的构建
            2.1.3 重组质粒的获取
        2.2细胞实验
            2.2.1 细胞复苏及传代
            2.2.2 细胞转染
        2.3 荧光素酶报告
    3.结果
        3.1 sox3靶miRNA的预测及选择
        3.2 质粒图谱
        3.3 质粒验证
        3.4 转染效率验证
        3.5 荧光素酶报告结果
    4.讨论
小结
参考文献
硕士期间发表的文章
致谢



本文编号：3815854