MinE基因功能初步研究及木薯淀粉含量测定方法探究

发布时间：2023-06-08 20:54

　　MinE蛋白在质体分裂中起着关键作用。本研究从木薯(Manihot esculenta Crantz)基因组中分离出MinE基因(MeMinE),并对其进行相关生物信息学分析及木薯不同部位特异性表达分析。高浓度及高活力的木薯叶肉原生质体被分离纯化出来,并成功地在木薯叶肉原生质体中进行GFP融合的MeMinE蛋白的瞬时表达。结果显示MeMinE蛋白定位于叶绿体上,且木薯叶肉原生质体中MeMinE蛋白的过量表达可导致木薯叶肉原生质体中叶绿体的数量和大小显著减小。在大肠杆菌中MeMinE蛋白的过量表达也会造成大肠杆菌的不正常分裂,造成细胞两级异常分裂进而导致小细胞的出现。通过转基因技术,将重组工程菌pCAMBIA1300 eGFP-MeMinE转化木薯华南8号(SC8)体细胞子叶胚,获得MeMinE过表达的幼苗。本研究比较了木薯和马铃薯淀粉颗粒的形状,直径和分子量大小的差异。结果显示木薯淀粉颗粒通常呈现多面体并且一端被截断的形状,而马铃薯淀粉颗粒呈现规则的椭圆形。木薯淀粉颗粒的直径大多处在0-20μm之间,而马铃薯淀粉颗粒的直径大多处在740μm之间。木薯淀粉颗粒的平均直径比马铃薯淀粉颗粒的...

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摘要
abstract
1 前言
    1.1 木薯的研究背景及意义
    1.2 叶绿体的产生及分裂
    1.3 Min系统在原核细胞分裂中的调控
    1.4 原生质体的瞬时基因表达
    1.5 木薯遗传转化体系的研究进展
    1.6 淀粉的构成及作用
    1.7 淀粉含量测定研究进展
    1.8 本研究的目的和意义
    1.9 技术路线
2 木薯MinE基因生物信息学分析
    2.1 木薯MinE基因结构分析
    2.2 MinE蛋白多序列比对
    2.3 木薯MinE蛋白三维结构预测
    2.4 MinE蛋白进化树分析
3 qPCR检测MinE基因在木薯生长不同阶段及不同部位表达量
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 试剂盒
        3.1.3 主要仪器设备
    3.2 方法
        3.2.1 RNA的提取及反转录
        3.2.2 引物的设计
        3.2.3 PCR程序
    3.3 结果分析
        3.3.1 不同生长阶段差异表达分析
        3.3.2 不同部位差异表达分析
    3.4 讨论
4 木薯MinE基因的克隆及两种表达载体的构建
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株及质粒
        4.1.3 工具酶与试剂盒
        4.1.4 主要仪器及设备
        4.1.5 培养基及相关溶液的配制
    4.2 方法
        4.2.1 木薯SC8组培苗的获取
        4.2.2 RNA的提取及反转录
        4.2.3 引物的设计
        4.2.4 RT-PCR反应
        4.2.5 目的条带的纯化
        4.2.6 目的片段和质粒的酶切、纯化、连接
        4.2.7 连接产物转化感受态大肠杆菌
        4.2.8 菌落PCR验证
        4.2.9 重组质粒的提取,双酶切及测序验证
        4.2.10 植物表达载体转化农杆菌GV3101及阳性克隆筛选
        4.2.11 原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)及阳性克隆筛选
    4.3 结果分析
        4.3.1 木薯组培苗的获取
        4.3.2 RNA条带跑胶验证、RT-PCR验证及菌液PCR验证
        4.3.3 重组质粒双酶切及测序验证
    4.4 讨论
5 木薯原生质体的分离
    5.1 材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 试剂配制
        5.1.3 主要仪器设备
    5.2 方法
        5.2.1 植物材料的选取
        5.2.2 叶片的酶解
        5.2.3 原生质体的纯化,及FDA染色检测原生质体的活性
    5.3 结果分析
        5.3.1 原生质体数量及活力的镜检
    5.4 讨论
6木薯叶肉原生质体的转染及MinE蛋白过表达对叶绿体分裂影响
    6.1 材料
        6.1.1 植物材料
        6.1.2 试剂及培养基配制
        6.1.3 试剂盒及主要仪器设备
    6.2 方法
        6.2.1 无内毒素质粒大提
        6.2.2 质粒转染原生质体
        6.2.3 共焦距显微镜的使用
    6.3 结果分析
        6.3.1 无融合GFP蛋白及MinE-eGFP融合蛋白的定位
        6.3.2 MinE蛋白对叶绿体分裂的影响
    6.4 讨论
7 大肠杆菌原核表达
    7.1 材料
        7.1.1 菌株
        7.1.2 试剂及培养基的配制
        7.1.3 主要仪器
    7.2 方法
    7.3 结果分析
        7.3.1 MinE蛋白的过表达对大肠杆菌分裂的影响
    7.4 讨论
8 农杆菌介导的稳定遗传转化
    8.1 材料
        8.1.1 植物材料
        8.1.2 试剂及培养基的配制
        8.1.3 主要仪器及设备
    8.2 方法
        8.2.1 体胚的诱导及继代
        8.2.2 子叶胚的诱导
        8.2.3 转化
        8.2.4 抗性芽的筛选
    8.3 结果分析
    8.4 讨论
9 电镜扫描
    9.1 材料
        9.1.1 主要仪器
    9.2 方法
        9.2.1 样本的制备
        9.2.2 扫描电镜的使用
    9.3 结果分析
    9.4 讨论
10 木薯直链淀粉及支链淀粉的分离及纯化
    10.1 材料
        10.1.1 淀粉材料
        10.1.2 试剂
        10.1.3 主要仪器
    10.2 方法
        10.2.1 原淀粉的提取
        10.2.2 索氏提取器的改良
        10.2.3 直链淀粉及支链淀粉的分离纯化
        10.2.4 淀粉纯度的测定
    10.3 结果分析
    10.4 讨论
11 双波长碘结合法中标准曲线的绘制
    11.1 材料
        11.1.1 淀粉材料
        11.1.2 试剂及溶液的配制
        11.1.3 主要仪器
    11.2 方法
        11.2.1 标准溶液的配置
        11.2.2 测定波长的选取
        11.2.3 标准曲线及淀粉含量测定公式的确定
    11.3 结果分析
    11.4 讨论
12 双波长法及Megazyme试剂盒法测木薯淀粉标品准混合物含量
    12.1 材料
        12.1.1 木薯材料
        12.1.2 试剂及相关溶液的配置
        12.1.3 主要仪器及设备
    12.2 方法
        12.2.1 木薯直链淀粉标准品混合物的配置
        12.2.2 双波长法测木薯直链淀粉标准品混合物淀粉含量
        12.2.3 Megazyme试剂盒法测木薯淀粉标准品混合物淀粉含量
    12.3 结果分析
13 双波长法及Megazyme试剂盒法测田间木薯及土豆各品种淀粉含量
    13.1 材料
        13.1.1 田间材料的获取及处理
        13.1.2 试剂及相关溶液的配置
        13.1.3 主要仪器及设备
    13.2 方法
        13.2.1 双波长法测田间木薯及土豆各品种淀粉含量
        13.2.2 Megazyme试剂盒法测田间木薯及土豆各品种淀粉含量
    13.3 结果分析
    13.4 讨论
14 研究结论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3832477