灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因的全长cDNA克隆及定量表达分析

发布时间：2023-10-27 19:23

　　灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand-Mazz)作为重要的药用植物,在我国普遍种植,其有效成分绿原酸(chlorogenicacid,CGA)是植物重要的次生代谢产物,具有清热解毒、抗菌、抗病毒等重要的药用价值。而目前有关灰毡毛忍冬绿原酸合成的分子机制以及关键酶基因的研究还不够深入,因此,本论文从基因克隆、绿原酸测定、表达模式分析、原核表达、以及载体构建等方面入手,对灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因进行全长cDNA克隆及定量表达分析,以期为研究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成的分子机制奠定理论基础。本论文的主要研究内容如下:(1)采用RACE方法,克隆了灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT的全长cDNA序列,结果显示Lm4CL基因全长1960 bp(GenBank:MN103349),CDS 全长 1617bp,编码 539 个氨基酸,LmHCT基因得到部分片段 840 bp,LmCCoAOMT基因全长 1096 bp(GenBank:MN103348),CDS全长735 bp,编码245个氨基酸。通过聚类分析发现,灰毡毛...

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 药用植物的研究进展
    1.2 植物绿原酸生物合成的研究进展
    1.3 国内外研究现状及发展动态
    1.4 植物绿原酸合成关键酶基因研究现状
        1.4.1 4CL基因的研究进展
        1.4.2 HCT基因的研究进展
        1.4.3 CCoAOMT基因的研究进展
    1.5 本文研究的工作设想
        1.5.1 研究目的与意义
        1.5.2 研究内容与技术路线
第2章 灰毡毛忍冬Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT基因的克隆与生物信息学分析
    2.1 实验材料与仪器
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 材料的采集与处理
        2.2.2 总RNA的提取
        2.2.3 cDNA第一链的合成
        2.2.4 Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT基因中间片段引物设
        2.2.5 RACE技术的实验原理以及目的基因全长cDNA的克隆
        2.2.6 PCR扩增产物的胶回收
        2.2.7 大肠杆菌感受态的制备
        2.2.8 目的基因与载体的连接
        2.2.9 连接产物的转化
        2.2.10 PCR反应体系及程序
        2.2.11 Lm4CL、LmCCoAOMT的生物信息学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 Lm4CL基因的全长cDNA克隆
        2.3.2 LmHCT基因的全长cDNA克隆
        2.3.3 LmCCoAOMT基因的全长cDNA克隆
        2.3.4 Lm4CL基因序列分析
        2.3.5 LmCCoAOMT基因序列分析
        2.3.6 Lm4CL、LmCCoAOMT生理生化性质分析
        2.3.7 Lm4CL、LmCCoAOMT二级结构及三级结构的预测
    2.4 小结
第3章 灰毡毛忍冬关键酶基因表达模式分析
    3.1 材料和试剂
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 Lm4CL、LmHCT和LmCCoAOMT引物设计
        3.2.2 RNA的提取及逆转录
        3.2.3 定量PCR分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 Lm4CL基因的表达模式分析
        3.3.2 LmHCT基因的表达模式分析
        3.3.3 LmCCoAOMT基因的表达模式分析
    3.4 小结
第4 关键酶基因表达量与绿原酸含量相关性分析
    4.1 实验材料
    4.2 实验方法
        4.2.1 绿原酸含量的测定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 4CL基因表达量与绿原酸含量相关性分析
        4.3.2 HCT基因表达量与绿原酸含量相关性分析
        4.3.3 CCoAOMT基因表达量与绿原酸含量相关性分析
    4.4 小结
第5章 灰毡毛忍冬绿原酸合成关键基因的原核表达
    5.1 实验材料
    5.2 实验方法
        5.2.1 酶切与酶连
        5.2.2 大肠杆菌BL21(star)感受态的制备
        5.2.3 大肠杆菌BL2l(star)转化
        5.2.4 Lm4CL和LmCCoA OMT基因的原核表达
        5.2.5 目的蛋白的纯化
    5.3 结果与分析
        5.3.1 Lm4CL基因的原核表达
        5.3.2 LmCCoAOMT基因的原核表达
    5.4 小结
第6章 Lm4CL、LmCCoAOMT基因过表达载体的构建
    6.1 实验材料
    6.2 实验方法
        6.2.1 农杆菌感受态的制备
        6.2.2 农杆菌感受态的转化
    6.3 结果与分析
        6.3.1 Lm4CL-1301过表达载体的构建
        6.3.2 LmCCoAOMT-1301过表达载体的构建
    6.4 小结
第7章 结论与讨论
参考文献
附录A 攻读学位期间发表的学术论文
附录B 参与项目课题
附录C 基因登录号
致谢



本文编号：3857119