低聚龙胆糖制备用酶的基因挖掘、重组表达及复配应用

发布时间：2023-11-20 18:38

　　低聚龙胆糖(Gentiooligsaccharide)是一类葡萄糖经由β-1,6-糖苷键连接形成的新型功能性低聚糖,包括龙胆二糖、少量的龙胆三糖和四糖,它具有低热量、低甜度的特性和清理肠道的功能,被广泛应用于甜品、饮料行业。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,简称Bgl)能以葡萄糖为底物,通过逆水解反应制备低聚龙胆糖,然而,产物中除少量纤维二糖、昆布二糖、槐糖等副产物外,基本只含有龙胆二糖,无法检测出三糖及以上聚合度的寡糖。有资料表明,β-1,6-葡聚糖酶(β-1,6-glucanase,简称Bgn16)能以龙胆二糖作为供、受体底物,合成龙胆三糖乃至四糖。本研究通过序列分析、表达验证和定点突变探究了GH3家族β-葡萄糖苷酶逆水解反应机制,确定了影响酶逆水解活性的关键氨基酸。基于上述研究结果,从数据库中挖掘出具备高逆水解活性的Talaromyces cellulolyticusβ-葡萄糖苷酶TcBgl3A,并选取T.cellulolyticus来源的β-1,6-葡聚糖酶TcBgn16与TcBgl3A协同制备低聚龙胆糖。最后,对重组菌P.pastoris KM71/pPIC9K-t...

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 低聚龙胆糖概述
        1.1.1 低聚龙胆糖的结构、性质及应用
        1.1.2 低聚龙胆糖的制备
    1.2 β-葡萄糖苷酶概述
        1.2.1 β-葡萄糖苷酶的来源及应用
        1.2.2 β-葡萄糖苷酶的结构和催化机制
    1.3 β-1,6-葡聚糖酶概述
        1.3.1 β-1,6-葡聚糖酶的来源
        1.3.2 β-1,6-葡聚糖酶的反应类型及应用
    1.4 毕赤酵母表达系统概述
    1.5 立题依据和研究意义
    1.6 论文研究主要内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 表达菌株和质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 培养基
    2.2 分子生物学基本方法
        2.2.1 质粒提取、产物纯化、琼脂糖凝胶回收
        2.2.2 E.coli BL21(DE3)感受态细胞的转化及转化子筛选
        2.2.3 P.pastoris KM71 感受态细胞的制备、转化及转化子筛选
        2.2.4 TpBgl3A的突变体构建
    2.3 分析方法
        2.3.1 菌体浓度的测定
        2.3.2 SDS-PAGE电泳分析
        2.3.3 蛋白浓度的测定
        2.3.4 重组β-葡萄糖苷酶及β-1,6-葡聚糖酶的酶活测定
        2.3.5 重组β-1,6-葡聚糖酶的纯化
        2.3.6 重组β-葡萄糖苷酶及β-1,6-葡聚糖酶的酶学性质测定
        2.3.7 重组β-葡萄糖苷酶的动力学及转苷/水解比参数测定
        2.3.8 重组β-1,6-葡聚糖酶的底物特异性分析
    2.4 发酵方法
        2.4.1 重组P.pastoris KM71 的摇瓶发酵
        2.4.2 重组E.coli BL21(DE3)的摇瓶发酵
        2.4.3 重组P.pastoris KM71的3.6 L罐高密度发酵
    2.5 低聚龙胆糖的制备
        2.5.1 β-葡萄糖苷酶制备龙胆二糖
        2.5.2 β-葡萄糖苷酶与β-1,6葡聚糖酶协同制备低聚龙胆糖
        2.5.3 低聚龙胆糖的检测
    2.6 基因筛选与分子对接
        2.6.1 GH3家族β-葡萄糖苷酶的基因筛选
        2.6.2 结构模拟与分子对接
第三章 结果与讨论
    3.1 +1受体位点对β-葡萄糖苷酶逆水解活性影响的机制研究
        3.1.1 β-葡萄糖苷酶的基因筛选及其在龙胆二糖制备中的性能表征
        3.1.2 +1受体位点对酶逆水解活性影响的机制研究
    3.2 高逆水解活性β-葡萄糖苷酶的基因挖掘及应用
        3.2.1 基于优势特征序列的高逆水解活性酶的基因挖掘及重组表达
        3.2.2 T.cellulolyticusβ-葡萄糖苷酶的酶学性质
        3.2.3 T.cellulolyticusβ-葡萄糖苷酶制备龙胆二糖的条件优化
    3.3 β-葡萄糖苷酶与β-1,6-葡聚糖酶协同制备低聚龙胆糖的研究
        3.3.1 T.cellulolyticusβ-1,6-葡聚糖酶的重组表达
        3.3.2 T.cellulolyticusβ-1,6-葡聚糖酶的酶学性质
        3.3.3 TcBgl3A与 TcBgn16 协同制备低聚龙胆糖的应用研究
    3.4 重组菌的3.6L罐高密度发酵水平初步研究
        3.4.1 重组菌P.pastoris KM71/pPIC9K-tcbgl3a的3.6 L罐发酵
        3.4.2 重组菌P.pastoris KM71/pPIC9K-tcBgn16的3.6 L罐发酵
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文



本文编号：3865613