芸薹生链格孢致病缺陷突变体AbS4b突变基因的鉴定及功能研究
发布时间：2024-12-22 03:05
芸薹生链格孢（Alternaria brassicicola）是十字花科蔬菜的一个重要致病真菌,其侵染引起的黑斑病会导致十字花科蔬菜产、质量严重下降。对该病原菌致病机理的深入研究有助于黑斑病的防治。蓝光对病原菌的生长发育、有性生殖及无性生殖、体内的新陈代谢、产孢以及致病力等方面均能起到重要调控作用。因此,本研究从致病缺陷突变体AbS4b入手,明确其突变基因为蓝光调节蛋白基因Abblr,进一步对该基因的功能进行了研究,结果如下:（1）利用离体叶片接种法对芸薹生链格孢转化子库进行致病缺陷突变体的筛选,共得到5株致病能力显著下降的突变体,其中致病能力完全丧失的有2株,分别是AbM1a和AbS4b;致病能力明显下降的有3株,分别为AbF7a、AbS2b、AbS3b。利用hiTAIL-PCR技术成功扩增到了突变体AbS4b的质粒插入基因为蓝光调节蛋白基因,将其命名为Abblr（Alternaria brassicicola blue light regulator）。（2）Abblr基因全长1432 bp,含有一个52 bp的内含子,编码459个氨基酸,包含一个PAS结构域和一个ZnFG...
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 引言
1.1 芸薹生链格孢与黑斑病
1.2 芸薹生链格孢菌的致病机制
1.3 蓝光受体蛋白概述
1.3.1 真菌与蓝光响应
1.3.2 White Collar系同源物(WC)
1.3.3 蓝光受体相关基因的功能研究
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 供试菌株与培养条件
2.1.2 质粒载体
2.1.3 主要试验试剂
2.1.4 主要溶剂及培养基的配制
2.1.5 主要试验仪器
2.1.6 PCR引物序列
2.2 试验方法
2.2.1 突变体的筛选
2.2.2 CTAB法提取全基因组DNA
2.2.3 芸薹生链格孢基因组RNA的提取
2.2.4 cDNA的合成
2.2.5 突变体基因突变位点的确定
2.2.6 hiTAIL-PCR技术扩增侧翼序列
2.2.7 Abblr基因的克隆及序列分析
2.2.8 Abblr基因打靶载体的构建
2.2.9 大肠杆菌感受态转化
2.2.10 质粒提取
2.2.11 重组DNA片段的大量扩增及浓缩
2.2.12 原生质体的制备
2.2.13 原生质体的转化
2.2.14 Abblr基因缺失突变体的筛选与验证
2.2.15 回补体的构建与验证
2.2.16 Abblr基因缺失突变体致病机理功能研究
2.3 数据统计分析
3 结果与分析
3.1 芸薹生链格孢致病缺陷突变体的筛选
3.2 芸薹生链格孢致病缺陷突变体基因突变位点的确定
3.3 芸薹生链格孢Abblr基因的克隆及生物学分析
3.3.1 芸薹生链格孢Abblr基因的克隆
3.3.2 芸薹生链格孢Abblr基因的生物学分析
3.4 芸薹生链格孢Abblr基因的敲除
3.5 芸薹生链格孢Abblr基因缺失突变体的筛选验证
3.5.1 PCR筛选验证
3.5.2 Southern杂交验证
3.6 芸薹生链格孢回补体的构建与筛选验证
3.7 Abblr基因缺失突变体的相关功能研究
3.7.1 Abblr基因缺失突变体菌落形态的观察
3.7.2 Abblr基因缺失突变体菌落生长速度的测定
3.7.3 Abblr基因缺失突变体的菌丝及孢子形态观察
3.7.4 Abblr基因缺失突变体的致病力测定
3.7.5 Abblr基因缺失突变体玻璃纸穿透能力的测定
3.7.6 Abblr基因缺失突变体H2O2 降解能力的测定
3.7.7 Abblr基因缺失突变体光修复能力的测定
3.7.8 Abblr基因缺失突变体产类胡萝卜素能力的测定
3.7.9 Abblr基因缺失突变体诱导分生孢子的测定
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
本文编号：4019333
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 引言
1.1 芸薹生链格孢与黑斑病
1.2 芸薹生链格孢菌的致病机制
1.3 蓝光受体蛋白概述
1.3.1 真菌与蓝光响应
1.3.2 White Collar系同源物(WC)
1.3.3 蓝光受体相关基因的功能研究
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 供试菌株与培养条件
2.1.2 质粒载体
2.1.3 主要试验试剂
2.1.4 主要溶剂及培养基的配制
2.1.5 主要试验仪器
2.1.6 PCR引物序列
2.2 试验方法
2.2.1 突变体的筛选
2.2.2 CTAB法提取全基因组DNA
2.2.3 芸薹生链格孢基因组RNA的提取
2.2.4 cDNA的合成
2.2.5 突变体基因突变位点的确定
2.2.6 hiTAIL-PCR技术扩增侧翼序列
2.2.7 Abblr基因的克隆及序列分析
2.2.8 Abblr基因打靶载体的构建
2.2.9 大肠杆菌感受态转化
2.2.10 质粒提取
2.2.11 重组DNA片段的大量扩增及浓缩
2.2.12 原生质体的制备
2.2.13 原生质体的转化
2.2.14 Abblr基因缺失突变体的筛选与验证
2.2.15 回补体的构建与验证
2.2.16 Abblr基因缺失突变体致病机理功能研究
2.3 数据统计分析
3 结果与分析
3.1 芸薹生链格孢致病缺陷突变体的筛选
3.2 芸薹生链格孢致病缺陷突变体基因突变位点的确定
3.3 芸薹生链格孢Abblr基因的克隆及生物学分析
3.3.1 芸薹生链格孢Abblr基因的克隆
3.3.2 芸薹生链格孢Abblr基因的生物学分析
3.4 芸薹生链格孢Abblr基因的敲除
3.5 芸薹生链格孢Abblr基因缺失突变体的筛选验证
3.5.1 PCR筛选验证
3.5.2 Southern杂交验证
3.6 芸薹生链格孢回补体的构建与筛选验证
3.7 Abblr基因缺失突变体的相关功能研究
3.7.1 Abblr基因缺失突变体菌落形态的观察
3.7.2 Abblr基因缺失突变体菌落生长速度的测定
3.7.3 Abblr基因缺失突变体的菌丝及孢子形态观察
3.7.4 Abblr基因缺失突变体的致病力测定
3.7.5 Abblr基因缺失突变体玻璃纸穿透能力的测定
3.7.6 Abblr基因缺失突变体H2O2 降解能力的测定
3.7.7 Abblr基因缺失突变体光修复能力的测定
3.7.8 Abblr基因缺失突变体产类胡萝卜素能力的测定
3.7.9 Abblr基因缺失突变体诱导分生孢子的测定
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
本文编号：4019333
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/4019333.html
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