利用CRISPR/Cas9技术高效诱导基因表达的无克隆方法

发布时间：2024-12-22 02:19

　　目的:利用CRISPR/Cas9技术简单高效地激活内源性基因表达的研究。方法:通过合成的sgRNA表达盒去指导一个包含转录激活因子(VP64,p65和Rta)并且无核酸酶的Cas9复合物,从而进行位点特异性诱导内源性基因的表达。我们设计了SpCas9 sgRNA表达盒与SaCas9 sgRNA表达盒,通过诱导人和大鼠细胞中的多个基因,测试两种CRISPR激活系统(dSpCas9-VPR,dSaCas9-VPR)。我们通过pmaxGFP转染法检测不同细胞的转染效率,使用CRISPR/Cas9激活剂进行基因激活,应用qPCR比较目的基因的相对表达量,用免疫细胞化学方法检测被转录因子诱导的基因表达。结果:两种CRISPR/Cas9均可在人体细胞中有效诱导激活六种不同的神经发育基因(CRX,RORB,RAX,OTX2,ASCL1和NEUROD1),而在大鼠细胞诱导激活三种不同基因(Ascl1,Neurod1和Nrl)表现出更多不确定性以及低效的基因诱导水平。结论:本研究提供了一种简单地使用CRISPR/Cas9激活剂有效激活内源性基因表达的方法,该方法能优化实验室工作流程,有助于推动分子细胞生物...

【文章页数】：57 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 CRISPR/Cas9系统的背景介绍
    1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术基本原理
        1.2.1 CRISPR/Cas9系统工作流程
        1.2.2 sg RNA与CRISPR/Cas9的相互作用
        1.2.3 Cas9的常用类型概述
    1.3 d Cas9激活系统概述
        1.3.1 d Cas9-VPR
        1.3.2 d Cas9-SAM
        1.3.3 d Cas9-Sun Tag
    1.4 CRISPR/Cas9在视网膜疾病的应用
        1.4.1 CRISPR/Cas9在视网膜疾病模型的应用
        1.4.2 CRISPR/Cas9对视网膜疾病的基因治疗
    1.5 CRISPR/Cas9与细胞直接重编程
    1.6 本实验研究的目的与意义
第二章
    引言
    材料与方法
        2.1 主要实验器材和试剂
        2.2 sg RNA设计与表达盒的制备
            2.2.1 Sp Cas9、Sa Cas9和sg RNA表达盒的设计
            2.2.2 PCR扩增sg RNA表达盒
            2.2.3 凝胶电泳
            2.2.4 提取sg RNA表达盒
        2.3 细胞培养
            2.3.1 溶液配制
            2.3.2 细胞复苏
            2.3.3 细胞维持
            2.3.4 细胞传代
            2.3.5 细胞冻存
        2.4 转染效率分析
        2.5 使用CRISPR/Cas9进行基因激活
        2.6 q PCR分析
            2.6.1 RNA的提取
            2.6.2 c DNA的合成
            2.6.3 基因表达测定
        2.7 免疫细胞化学分析
            2.7.1 溶液配制
            2.7.2 免疫染色
        2.8 数据分析
第三章 结果
    3.1 在人体细胞中测试d Sp Cas9-VPR系统
    3.2 在鼠类细胞中测试d Sp Cas9-VPR系统
    3.3 在人体细胞中测试d Sa Cas9-VPR系统
    3.4 在大鼠细胞中测试d Sa Cas9-VPR系统
第四章 讨论
第五章 结论
第六章 展望
参考文献
附录
索引
在校期间发表论文及科研成果
致谢



本文编号：4019283