基因内miR-135a-1/2自身转录调控机制的研究

发布时间：2024-12-22 00:31

　　Micro RNA（mi RNA）是一类大小约为22个核苷酸的内源性短非编码RNA,广泛存在于动植物体内,通常结合机体内靶m RNA 3’非编码区（3’UTR）从而抑制m RNA的翻译进而对基因表达起负调控作用。根据mi RNA在基因组上与其它转录单位的位置关系,mi RNA可分为基因间mi RNA（intergenic mi RNAs）和基因内mi RNA（intragenic mi RNA）,而后者包括蛋白质编码基因的外显子或内含子mi RNA。目前,尽管在动物和植物中对mi RNA功能研究已经揭示的很清楚了,但对mi RNA基因自身的转录了解仍十分有限,而对位于基因内的mi RNA及其与宿主基因的转录关系,更是知之甚少。本实验室前期对mi R-135a在脂肪生成的作用和功能进行了探索研究,但mi R-135a在脂肪生成过程中的本身转录机制并不清楚。因此,本研究采用生物信息学预测、启动子双荧光素酶报告基因载体、点突变、EMSA、Ch IP、Ch IP-q PCR、q-PCR和western blot等实验技术对mi R-135a-1/2的转录机制进行了研究,主要研究结果如下:1.mi...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
中英文缩写对照表
第一章 文献综述
    1 引言
    2 miRNA的发现及特征
        2.1 miRNA的发现
        2.2 miRNA的特征
    3 miRNA在基因组上的位置
    4 miRNA的生物合成及作用机制
    5 miRNA家族
    6 调控脂肪生成的重要转录因子
    7 STAT5
    8 miR-135的研究综述
    9 选题的目的和意义
第二章 材料与方法
    1 试验材料
        1.1 DNA样品
        1.2 载体与菌株
        1.3 主要试剂和仪器
        1.4 主要试剂配制
        1.5 主要数据库及分析软件
    2 试验方法
        2.1 启动子预测及其双荧光素酶报告基因载体的构建
            2.1.1 miRNA启动子区域的预测
            2.1.2 预测的启动子双荧光素酶报告基因载体的构建
        2.2 细胞培养及诱导分化
            2.2.1 细胞的复苏
            2.2.2 细胞的常规培养
            2.2.3 细胞冻存
            2.2.4 3T3-L1细胞的诱导分化
            2.2.5 细胞基因组DNA、总RNA及总蛋白的提取
        2.3 细胞转染及双荧光素酶活性的测定
            2.3.1 细胞的转染
            2.3.2 双荧光素酶相对活性的检测
        2.4 预测核心启动子片段中转录因子和突变载体的构建及荧光素酶活性检测
            2.4.1 预测核心启动子片段中转录因子
            2.4.2 核心转录因子STAT5a双荧光素酶突变载体的构建及荧光活性检测23
        2.5 EMSA和Ch IP验证转录因子STAT5a在细胞体外体内与miR-135a-1/2 启动子结合
            2.5.1 EMSA验证转录因子STAT5a在细胞体外与miR-135a-1/2 启动子结合
            2.5.2 Ch IP验证转录因子STAT5a在细胞体内与miR-135a-1/2 启动子结合
        2.6 超表达转录因子质粒的构建
        2.7 Q-PCR分析
            2.7.1 miRNA的定量分析
            2.7.2 基因的定量分析
            2.7.3 Ch IP-qPCR
        2.8 油红O染色
        2.9 Western blotting分析
            2.9.1 蛋白浓度测定
            2.9.2 SDS-PAGE电泳
            2.9.3 转膜
            2.9.4 抗原抗体免疫反应
            2.9.5 抗体
        2.10 统计学分析
第三章 结果与分析
    1 miR-135a-1 和miR-135a-2 分别在其宿主基因上的位置
    2 miR-135a-1 启动子区域及调节元件鉴定
        2.1 网站预测miR-135a-1 启动子区域
        2.2 miR-135a-1 启动子区域分段载体的构建及双荧光活性分析
        2.3 miR-135a-1 核心转录因子的鉴定
    3 miR-135a-2 启动子区域及调节元件鉴定
        3.1 网站预测miR-135a-2 启动子区域
        3.2 miR-135a-2 启动子区域分段载体的构建及双荧光素酶活性分析
        3.3 STAT5a同样结合在miR-135a-2 的核心启动子区域
        3.4 EMSA和Ch IP验证STAT5a在细胞体外体内结合miR-135a-1/2 启动子
    4 STAT5a上调miR-135a的表达
    5 STAT5a与APC之间存在着潜在的负反馈调节环路
第四章 讨论
结语
    1 研究结论
    2 创新性
    3 研究的不足之处
参考文献
附录
研究生在读期间发表的主要论文
致谢



本文编号：4019158