B.subtilis酱香风味酶基因的筛选及其敲除载体的构建

发布时间：2025-01-06 04:02

　　枯草芽孢杆菌属于食品安全级微生物(GRAS),广泛应用于生物防治、食品发酵、工业蛋白酶生产等。酱香是一种复合香,B.subtilis是酱香形成的主要微生物,迄今为止,酱香形成的分子机制仍不清楚。为探索酱香产生机制,研究通过对产酱香枯草芽孢杆菌BJ3-2和不产酱香枯草芽孢杆菌10075的3代基因组测序和转录组测序进行差异性分析,筛选得到9个酱香风味酶基因,确立靶基因rocG(谷氨酸脱氢酶)。结合实验室前期研究验证的酱香风味酶基因alsS(乙酰乳酸合成酶),针对两个靶基因rocG和als S,构建了四个CRISPR/Cas9敲除载体,主要研究内容及结果如下:1.通过产酱香枯草芽孢杆菌BJ3-2与不产酱香枯草芽孢杆菌10075共性蛋白对比,初步分析酱香风味的形成可能与基因重排有关。2.分析3代基因组测序和2代转录组测序结果,通过比较产酱香枯草芽孢杆菌BJ3-2和不产酱香枯草芽孢杆菌10075的基因组差异,基因表达量差异,结合模式菌株B.subtilis168和GO、KEGG等数据库,筛选获得酱香风味酶基因speD、rocF、hutG、PRODH、celF、hutI、celB、OxdD、rocG...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 前言
    1.1 酱香风味及其研究现状
        1.1.1 酱香风味形成机制
        1.1.2 酱香风味物质
        1.1.3 酱香风味物质研究进展
    1.2 枯草芽孢杆菌酱香风味酶基因
        1.2.1 酱香风味酶基因的筛选方法
        1.2.2 酱香风味酶基因
    1.3 CRISPR/Cas技术
        1.3.1 CRISPR/Cas系统的组成
        1.3.2 CRISPR/Cas系统的分类
        1.3.3 CRISPR/Cas9系统的作用机制
        1.3.4 CRISPR/Cas系统在微生物中的应用进展
    1.4 研究的目的及意义
第二章 酱香风味酶基因的筛选
    2.1 材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 主要药品及试剂
        2.1.3 仪器
        2.1.4 培养基及试剂的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株培养
        2.2.2 基因组测序
        2.2.3 转录组测序
        2.2.4 基因组测序结果分析
        2.2.5 转录组测序分析
        2.2.6 酱香风味候选基因的筛选
        2.2.7 酱香风味差异基因的筛选
    2.3 实验结果
        2.3.1 基因组测序结果及分析
        2.3.2 转录组测序结果及分析
        2.3.3 酱香风味候选基因
        2.3.4 酱香风味差异基因rocG
    2.4 讨论
第三章 酱香风味酶基因alsS和rocGCRISPR/Cas9载体的构建
    3.1 材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 载体
        3.1.3 主要药品及试剂
        3.1.4 实验仪器
        3.1.5 培养基及试剂的配制
        3.1.6 PCR扩增引物
    3.2 实验方法
        3.2.1 p43/sgRNA重组质粒的构建及验证
        3.2.2 p43/sgRNA/donor重组质粒的构建与验证
    3.3 结果与分析
        3.3.1 alsS,rocG基因序列
        3.3.2 p43/sgRNA重组质粒的构建及验证
        3.3.3 p43/sgRNA/donor重组质粒的构建与验证
    3.4 讨论
第四章 结论与展望
    4.1 结论
    4.2 展望
参考文献
附录
致谢



本文编号：4023764