沙福芽孢杆菌耐锰基因的筛选与鉴定

发布时间：2025-02-13 19:54

　　锰在自然界中含量丰富,是生物体必需的微量元素之一。然而锰浓度过高,将造成生态环境的污染和机体内锰平衡被破坏,发生中毒,影响动物和人体健康。锰氧化细菌主要在淡水、海洋和土壤等环境中存在,其作用主要是将Mn(Ⅱ)氧化成Mn(Ⅲ)或者Mn(Ⅳ),这一生物氧化过程较非生物氧化过程具有快速的特点,是环境中锰氧化物形成的主要原因。国内外主要对少数种类的海洋细菌的锰氧化机制进行了研究,土壤锰氧化细菌的相关研究知之甚少。沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株S7是本实验室从锰冶炼区土壤分离得到的一株耐锰能力达到2200 mg/L的细菌。通过LBB试剂完成固体和液体氧化测定,同时将无锰培养和加锰培养的细菌做电子扫描电镜,观察到加锰培养的细菌表面有明显氧化物附着,从而推断该菌株确实具有锰氧化活性。在此基础上,选择使用转录组学(RNA-seq)技术比较在锰胁迫浓度为0 mg/L和250 mg/L处理下,沙福芽孢在对数生长期和稳定生长期的差异基因表达情况,培养时间分别为8 h、12 h、16 h和24 h共8个转录组。期望从中筛选出耐锰相关基因,为细菌锰氧化机制研究奠定理论基础。得到的结果如下:...

【文章页数】：159 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1 锰及其生物学功能
    2 耐锰机制及相关基因或酶类研究
        2.1 细菌的耐锰机制
        2.2 参与锰氧化的基因和酶类
    3 芽孢杆菌的基因敲除方法
        3.1 随机插入突变
        3.2 同源重组
    4 研究的目的及意义
第二章 材料和方法
    1 试验材料
        1.1 试验菌株
        1.2 试验试剂
        1.3 试验仪器
        1.4 主要溶液配制
        1.5 引物
    2 试验方法
        2.1 细菌的鉴定
        2.2 细菌的16SrDNA的检测
        2.3 细菌的革兰氏染色
        2.4 转录组测序
        2.5 RT-q PCR
        2.6 锰氧化活性的测定
        2.7 基因敲除
第三章 结果
    1 沙福芽孢杆菌的鉴定
    2 沙福芽孢杆菌的锰氧化活性
    3 运动能力的检测
    4 沙福芽孢杆菌在锰胁迫条件下转录组表达谱分析
        4.1 测序数据的生物信息学分析
        4.2 差异基因分析
        4.3 差异基因的功能注释及富集分析
    5 差异基因的表达验证
        5.1 基因片段克隆与测序
        5.2 标准曲线建立
        5.3 基因的表达
    6 基因敲除
        6.1 抗性浓度的筛选
        6.2 提取基因组DNA
        6.3 提取pPIC9K质粒
        6.4 同源臂和抗性基因的扩增
        6.5 构建重叠敲除片段
        6.6 阳性菌株的鉴定
        6.7 gene601基因的敲除对沙福芽孢杆菌锰氧化能力的影响
第四章 讨论
    1 转录组学分析
        1.1 对数生长期受锰影响的差异基因
        1.2 稳定生长期受锰影响的差异基因
    2 候选基因的RT-q PCR结果分析
    3 cotA基因的耐锰作用
第五章 结论
第六章 展望
致谢
参考文献
附录
    附录一 16个基因的序列
    附录二 17个基因的荧光定量标准曲线
    附录三 8个样品的差异表达基因表
    附录四 项目资助和文章发表



本文编号：4034033