日本沼虾抗菌肽基因的筛选和生物信息学分析

发布时间：2017-06-24 15:08

  本文关键词：日本沼虾抗菌肽基因的筛选和生物信息学分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是存在于甲壳动物和马蹄蟹中的一种具有广谱抗菌活性和抗病毒活性的抗菌肽。本研究中,我们通过从已经建立的日本沼虾转录组中分析筛选出6种ALF基因序列,分别命名为MnALF1-6,并通过cDNA末端快速扩增的方法克隆了它们的全长cDNA序列。根据分子系统发育分析显示,这些基因的产物都与罗氏沼虾同系物具有很高的相似性,尤其在LPS结构域部分。通过实时荧光定量PCR分析,在健康成虾的血细胞中MnALF2和MnALF4的相对表达量最高,在肠道中MnALF3和MnALF4的相对表达量最高。在嗜水气单胞菌的免疫诱导下,沼虾不同组织中少数ALF基因出现下调表达,但多数ALF基因呈上调表达模式。为了验证ALF的抗菌活性与LPS结构域的关系,我们合成了MnALF2的LPS结构域部分肽段,用来进行抑菌实验和溶血活性实验。抗菌活性实验发现合成的MnALF2多肽对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有强大的广谱抗菌活性,但对真菌没有明显的抑制活性。溶血实验中合成的MnALF2多肽在浓度为0.67-33.50μM时表现出较弱的溶血活性(约10%),在浓度达到67μM时溶血活性约为22%。这项研究有利于我们更深入的了解淡水虾先天免疫中ALFs的抗菌作用,并表明这些抗菌肽或其衍生物有可能成为一种高效的新型抗菌药物。利用本地库比对程序,在日本沼虾转录组中查找罗氏沼虾Crustin基因的同源序列,比对结果显示日本沼虾转录组中存在13条与罗氏沼虾Crustin相似性很高的序列。我们对这13条序列进行生物信息学分析,结果显示这13条序列都具有乳清酸蛋白(WAP)结构域且大多都存在信号肽,因此推测这13条序列应该是日本沼虾中存在的Crustin基因序列,并将其命名为MnCrustin1-13。日本沼虾Crustins是富含半胱氨酸的阳离子多肽,且一般在N端包含一个功能域(富含甘氨酸,脯氨酸或半胱氨酸),在C端含有一个带有4个二硫键的乳清酸蛋白(WAP)结构域。
【关键词】：抗脂多糖因子 先天性免疫 抗菌活性 Crustin 日本沼虾 序列多样性
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 前言10-20
• 1.1 抗菌肽10-11
• 1.2 昆虫抗菌肽11-13
• 1.3 甲壳动物抗菌肽13-19
• 1.3.1 Crustin15-17
• 1.3.2 抗脂多糖因子17-19
• 1.4 日本沼虾及其研究意义19-20
• 第二章 抗脂多糖因子的鉴定和功能分析20-37
• 2.1 实验材料20-21
• 2.1.1 实验材料来源20
• 2.1.2 实验试剂20
• 2.1.3 实验菌种20-21
• 2.2 实验方法21-25
• 2.2.1 日本沼虾总RNA的提取和反转录21
• 2.2.2 克隆日本沼虾ALFs基因的cDNA序列21-22
• 2.2.3 MnALFs基因序列的分析及系统发育树的构建22-23
• 2.2.4 日本沼虾的免疫诱导和组织的收集23
• 2.2.5 提取组织总RNA并进行实时荧光定量PCR23
• 2.2.6 数据统计与分析23
• 2.2.7 合成多肽MnALF2的抗菌活性实验23-24
• 2.2.8 合成多肽MnALF2的溶血活性测定24-25
• 2.3 实验结果25-34
• 2.3.1 MnALFs的克隆及同源性分析25-28
• 2.3.2 MnALFs结构分析28-29
• 2.3.3 MnALFs的表达模式分析29-32
• 2.3.4 MnALF2合成肽的抑菌实验结果32-33
• 2.3.5 MnALF2合成肽溶血实验结果33-34
• 2.4 讨论34-37
• 第三章 MnCrustin的生物信息学分析37-43
• 3.1 实验方法37
• 3.1.1 MnCrustins基因序列的生物信息学分析37
• 3.1.2 序列比对及系统发育树的构建37
• 3.2 实验结果37-42
• 3.2.1 日本沼虾Crustin基因cDNA序列分析37-39
• 3.2.2 日本沼虾Crustin基因的系统发育及蛋白结构分析39-42
• 3.3 讨论42-43
• 第四章 结论43-44
• 参考文献44-51
• 致谢51-52
• 攻读学位期间取得的成果52

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