牛支原体丙酮酸脱氢酶E1亚基基因的克

发布时间：2017-07-04 05:09

  本文关键词：牛支原体丙酮酸脱氢酶E1亚基基因的克隆、原核表达及α亚基单克隆抗体的制备

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【摘要】：牛支原体(Mycoplasma bovis)是牛的一种重要致病性支原体,可导致牛肺炎、乳房炎等一系列疾病。丙酮酸脱氢酶E1是生命体进行糖酵解的关键酶,而目前牛支原体丙酮酸脱氢酶E1的生物学功能研究,以及其是否可以作为牛支原体病诊断靶标的报道并不多见。本论文开展了牛支原体丙酮酸脱氢酶E1的克隆表达、单克隆抗体制备及其初步的生物学功能研究。本研究以PCR扩增获得pdhα和pdhβ基因,应用生物信息学软件对pdhα和pdhβ基因序列进行初步分析;构建原核表达质粒pET-pdhα和pET-pdhβ,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,应用Western blot及ELISA对E1?亚基和E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究;重组融合蛋白rPDHA免疫小鼠制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA检测能分泌预定抗体的阳性杂交瘤细胞并进行亚克隆筛选,同时对单克隆抗体的效价和反应特异性进行检测;利用带有GFP标签的E.coli-pdhα-gfp、E.coli-pdhβ-gfp表达菌感染NBL-4细胞,置于荧光显微镜观察黏附情况。结果显示:①pdhα与pdhβ基因序列与其他已报道的相关序列具有较高的相似性,E1α亚基和E1β亚基的表面可及性与抗原指数均较高;②pdhα与pdhβ基因在大肠杆菌中均成功表达,且均有良好的免疫原性,且Western blot及ELISA结果证实E1?和E1β在牛支原体细胞膜上和胞浆中均有分布且分布量相当;③筛选的2株单克隆抗体A12、B11的细胞上清效价为1:3 200左右,与牛支原体武威株及临洮株的反应特异性良好;④E.coli-pdhα-gfp、E.coli-pdhβ-gfp表达菌对NBL-4细胞有良好的黏附作用,其黏附作用可分别被抗rPDHA及rPDHB的多抗血清抑制,但E.coli-gfp表达菌对NBL-4细胞无黏附作用。研究结果表明,丙酮酸脱氢酶E1亚基可被呈递至牛支原体细胞膜,并具有一定的黏附特性,为深入研究牛支原体的致病机制奠定基础;E1α亚基单克隆抗体的制备可为进一步开发牛支原体诊断治疗相关产品提供参考资料。
【关键词】：牛支原体 丙酮酸脱氢酶E1 序列分析 亚细胞定位 单克隆抗体
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.62
【目录】：

• 摘要3-4
• Summary4-6
• 外文缩略语表6-10
• 第一章 文献综述10-16
• 1 牛支原体及其致病机理和诊断研究进展10-12
• 1.1 牛支原体10
• 1.2 牛支原体致病机理10-11
• 1.3 牛支原体相关疾病的诊断11-12
• 1.3.1 病原学诊断11
• 1.3.2 血清学诊断11
• 1.3.3 分子生物学诊断11-12
• 2 丙酮酸脱氢酶复合体及其生物学功能12-14
• 2.1 丙酮酸脱氢酶复合体的结构组成12
• 2.2 丙酮酸脱氢酶复合体的催化作用机理12-13
• 2.3 丙酮酸脱氢酶E1的结构及功能特性13-14
• 2.4 丙酮酸脱氢酶在支原体的相关研究14
• 4 本研究的目的意义14-16
• 第二章 牛支原体PDH E1亚基基因的克隆及相关信息分析16-24
• 1 材料16-18
• 1.1 菌种及载体16
• 1.2 仪器16
• 1.3 试剂16-18
• 1.3.1 主要试剂16-17
• 1.3.2 试剂配制17
• 1.3.3 培养基配制17-18
• 2 方法18-20
• 2.1 牛支原体基因组的粗提18
• 2.2 pdhα 和pdhβ 基因的扩增及优化18-19
• 2.3 目的基因序列相似性及抗原表位初步预测19-20
• 3 结果20-23
• 3.1 pdhα 和pdhβ 基因的扩增及序列分析20-21
• 3.2 pdhα 和pdhβ 基因序列相似性分析结果21-22
• 3.3 E1α、E1β 亚基抗原表位初步预测结果22-23
• 4 讨论23-24
• 第三章 牛支原体PDH E1亚基基因原核表达及亚细胞定位24-32
• 1 材料24-26
• 1.1 菌种、载体及试验动物24
• 1.2 仪器24
• 1.3 试剂24-26
• 1.3.1 主要试剂24-25
• 1.3.2 试剂配制25-26
• 2 方法26-27
• 2.1 原核表达载体的构建26
• 2.2 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析26
• 2.3 多克隆抗体的制备26
• 2.4 膜蛋白提取26
• 2.5 E1a、β 亚基在牛支原体细胞内的分布26-27
• 2.5.1 Western-blot分析27
• 2.5.2 ELISA检测27
• 3 结果27-29
• 3.1 原核表达质粒p ET-pdhα、p ET-pdhβ 的酶切鉴定27-28
• 3.2 r PDHA及r PDHB的诱导表达28
• 3.3 E1a、β 亚基在牛支原体细胞内的分布28-29
• 4 讨论29-32
• 第四章 牛支原体丙酮酸脱氢酶E1α 亚基单克隆抗体的制备32-41
• 1 材料32-33
• 1.1 试验动物、菌株、细胞及抗原32
• 1.2 仪器32-33
• 1.3 主要试剂33
• 2 方法33-37
• 2.1 BALB/c小鼠的免疫33
• 2.2 骨髓瘤细胞的培养33
• 2.3 饲养细胞的制备33-34
• 2.4 小鼠免疫脾细胞的制备34-35
• 2.5 确定最佳抗原包被量35
• 2.6 骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的融合35
• 2.7 杂交瘤细胞的抗体检测35-36
• 2.8 阳性杂交瘤细胞亚克隆筛选36
• 2.9 杂交瘤细胞的冻存与复苏36-37
• 2.10 单克隆抗体效价检测37
• 2.11 单克隆抗体特异性检测37
• 2.12 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测37
• 3 结果37-40
• 3.1 牛支原体抗原最佳包被浓度的确定37-38
• 3.2 细胞融合前小鼠尾血效价38
• 3.3 杂交瘤细胞株的建立38
• 3.4 单克隆抗体的生物学活性38-39
• 3.4.1 单克隆抗体效价38-39
• 3.4.2 单克隆抗体特异性39
• 3.5 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测39-40
• 4 讨论40-41
• 第五章 牛支原体丙酮酸脱氢酶E1亚基的黏附特性研究41-47
• 1 材料41-42
• 1.1 菌株、载体与细胞41
• 1.2 试剂41-42
• 2 方法42-43
• 2.1 荧光表达载体的构建42
• 2.2 重组菌的诱导表达42
• 2.3 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp对NBL-4 细胞的黏附试验42
• 2.4 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp对NBL-4 细胞的黏附抑制试验42-43
• 3 结果43-45
• 3.1 重组表达质粒的酶切鉴定43
• 3.2 重组菌的诱导表达43-44
• 3.3 E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp对NBL-4 细胞的黏附试验44
• 3.4 多抗血清对E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp的黏附抑制试验44-45
• 4 讨论45-47
• 全文结论47-48
• 参考文献48-54
• 致谢54-55
• 作者简介55-56
• 导师简介56-58

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