IVM小鼠脑组织神经活动配-体受体互作用通路基因表达改变可导致父源性子二代基因表达异常
本文关键词：IVM小鼠脑组织神经活动配-体受体互作用通路基因表达改变可导致父源性子二代基因表达异常
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【摘要】：目的：研究IVM小鼠F2代脑组织神经活动配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)通路基因Gabra6, Glra1, Gria4, Grid2, Agtr2, Slpr5, Galr1, Grm4在IVM F2代的表达情况以揭示上述IVM F1代新生期异常表达基因的传代效应,并进一步研究F2代中Glra1的甲基化状况及相应的蛋白表达情况。材料和方法：1.利用近交系C57BL/6J小鼠,通过单纯注射孕马血清获取未成熟卵,经体外成熟培养、ICSI辅助受精和胚胎移植等方法建立IVM小鼠模型。通过注射孕马血清和人绒毛膜促性腺激素获取成熟卵,经ICSI辅助受精和胚胎移植等方法建立VVM小鼠模型作为对照组,自然妊娠(natural conceived, NC)小鼠为阴性对照组。三组F1代新生小鼠各取一只处死后获得脑组织运用Mouse Genome 430 2.0芯片进行脑组织全基因表达谱分析,并通过进一步的Pathway分析提示神经活动配体-受体相互作用通路中Gabra6, Glra1, Gria4, Grid2, Agtr2, Slpr5, Galr1, Grm4基因表达差异最为显著。运用实时荧光定量PCR对上述F1代各组小鼠在新生及成年期都进行了验证检测,提示相比VVM组,IVM新生F1代雄雌小鼠中以上基因均出现了不同程度的上调,到成年后除IVM雌性小鼠Agtr2基因表达仍上调之外,其余的基因表达异常均得到纠正(具体数据详见2010年浙江大学王宁博士毕业论文)。2.对上述F1代性成熟期各组雌雄小鼠两两1：1自然交配,得到相应的F2代。将F2代的类型分为IVM组[包括IVM(?)+NC(?) (MN), IVM(?)+IVM(?)(MM),NC(?)+ IVM(?)(NM)]、VVM组[包括VVM(?)+NC(?)(IN), VVM(?)VVM(?)(Ⅱ), NC(?)+VVM(?)(NI)]、NC组[NC(?)+NC(?)]三大组,包括七个小组,每小组8只相应F2代小鼠。其中以NC F2代小鼠为阴性对照组。3.出生的F2代小鼠饲养至10周时,进行水迷宫实验,记录各组小鼠的潜伏期及穿台次数(该部分数据课题组先前已完成,数据暂未发表,各组间小鼠学习、认知能力未见明显差异,具体数据详见2010年浙江大学王宁博士毕业论文)后分别处死获取各组小鼠的脑组织。4.通过荧光定量PCR技术,检测10周各组小鼠脑组织的神经活动配体-受体相互作用通路中相关基因(Gabra6, Glra1, Gria4, Grid2, Agtr2, Slpr5, Galrl, Grm4)的表达。5.利用焦磷酸测序技术检测10周各组小鼠Glra1各位点的甲基化情况。6.通过western-blot技术,检测各组小鼠脑脏组织Glra1蛋白的表达。结果：1.IVM对F2代小鼠脑组织神经活动配体-受体相互作用通路各基因表达的影响与VVM组相比,IVM F2代小鼠10周时,脑组织中Glra1表达水平降低,差异具有统计学意义,其中以单一父源性因素影响最为明显(MN组F2代Glra1表达量较IN组差异最为明显)。各组间F2代小鼠脑组织Gria4, Grid2, Agtr2, Slpr5, Galr1, Grm4的表达差异无统计学意义。2.IVM对10周F2代小鼠脑组织Glra1甲基化修饰影响(1)比较NC组,IVMF2代小鼠脑组织Glra1的CpG2位点甲基化水平升高,差异具有统计学意义。与VVM小鼠F2代相比,甲基化水平也有升高,但未达差异的统计学意义。IVM小鼠脑组织Glra1的CpG6位点甲基化率相比VVM组及NC组均有显著性升高,差异具有统计学意义。而小鼠脑组织Glra1其他CpG位点甲基化状态三组间无统计学差异。(2)资料同时显示,单一性父源性因素对F2代小鼠脑组织甲基化率影响最为明显,在本研究进一步分析单纯IVM父源性小鼠所生子代(MN组)中Glra1的甲基化状态相比单纯VVM父源性小鼠(IN组)在CpG1、CpG2位点明显升高,差异具有统计学意义。3.IVM对F2代脑组织Glra1蛋白表达的影响相比NC组,10周IVMF2代小鼠脑组织Glra1蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义。但相比VVM组无明显统计学差异。其中从单一父源性因素对F2代Glra1蛋白表达的影响分析,通过对MN组和N组蛋白表达进行独立t检验,结果表明单纯IVM父源性小鼠所生子代(MN组)中Glra1的蛋白表达量较单纯VVM父源性小鼠(IN组)降低,差异具有统计学意义。结论：1.IVM新生F1代父源性小鼠脑组织神经活动配体-受体相互作用通路基因异常表达可导致F2代脑组织中的Glra1基因表达异常。2.IVM新生F1代脑组织中神经活动配体-受体相互作用通路基因的表达异常虽然在其成年后大部分可以纠正,但IVMF2代中Glral的表达仍可出现异常,这可能是由于F1代中异常表观修饰影响其雄性生殖系造成代间遗传导致的。3.IVMF2代小鼠虽然在表型上未见明显的神经系统及认知能力的发育差异,但存在潜在的神经系统疾病高发风险。尤其是父源性IVM F1代婚配可能对F2代的神经系统发育存在不良影响。
【关键词】：未成熟卵体外培养技术 神经活动配体-受体相互作用通路 甲基化修饰 小鼠模型 传代效应
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.8
【目录】：
- 致谢4-6
- 序言6-9
- 中文摘要9-12
- 英文摘要12-16
- 缩略词表16-18
- 引言18-21
- 1 材料和方法21-24
- 2 实验方法24-40
- 3 结果40-46
- 4 讨论46-50
- 5 结论50-51
- 参考文献51-55
- 综述55-67
- 参考文献61-67
- 作者简介67
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