苦荞芦丁降解酶基因多态性分析和蛋白重组表达及催化特性分析

发布时间：2017-07-13 21:25

  本文关键词：苦荞芦丁降解酶基因多态性分析和蛋白重组表达及催化特性分析

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【摘要】：苦荞种子中含有高活性的芦丁降解酶(Rutin Degrading Enzyme,RDE),芦丁降解酶属于β-D-糖苷酶家族,能够降解芦丁生成槲皮素和芸香糖苷,是造成苦荞面粉苦味的主要原因。本研究利用实验室已克隆的芦丁降解酶基因,设计引物扩增RDE基因组DNA,依据测序结果发现芦丁降解酶在基因组上存在3种拷贝形式rde1、rde2、rde3,其中rde1为无内含子的基因形式,rde2和rde3为有内含子的基因形式,rde3由12个外显子组成,rde2在rde3的第8外显子处插入新的内含子形成了13个外显子,两者相比外显子存在单碱基突变位点,内含子长度多态性是造成和两者差异的主要原因。相同的是rde2和rde3内含子中的AT含量高达70%,两者剪接位点碱基保守且遵循GT-AG规则。由此推测rde2和rde3可能为芦丁降解酶同源基因。在基因结构分析的基础上,构建rde真核重组表达载体pPICZαA-rde并转化毕赤酵母SMD1168H宿主菌,1%甲醇诱导诱导表达48 h后,表达上清硫酸铵分级沉淀,80%的丙酮洗涤溶解后,DEAE-Sepharose CL 6B纯化的蛋白经SDS-PAGE显示分子量为75KDa,重组芦丁降解酶(rRDE)分子量远大于预期分子量,PNGase F消化后分子量迁移到54 KDa,表明重组表达蛋白为N-连接的糖蛋白。研究建立了快速纯化苦荞籽粒芦丁降解酶的方法。利用芦丁降解酶对有机溶剂高耐受性的典型特性,基于不同浓度的甲醇对芦丁降解酶提取及活性的影响,结合非变性胶原位染色和酶活性分析确定芦丁降解酶提取最适甲醇浓度为40%,即在乙酸缓冲液提取后加入终浓度为40%的甲醇去除杂蛋白,在pH4.0条件下,提取液经强阳离子层析柱SP-Sepharose HP一步纯化得到分子量约为60 KDa的天然芦丁降解酶(nRDE),纯化效率可达70%左右。利用紫外分光光度计法对rRDE和nRDE的催化特性进行了比较分析,结果显示两者催化芦丁降解的最适p H均为5.0,rRDE最适温度为50℃,nRDE最适温度为40℃,催化芦丁的Km分别为5.375 mmol/L和11.333 mmol/L,nRDE的最大反应速率Vmax为是重组蛋白Vmax的10倍之多,推测不同来源芦丁降解酶翻译后修饰的不同是造成催化特性差异的主要原因。
【关键词】：苦荞 芦丁降解酶 基因多态性 毕赤酵母 重组表达 催化特性
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要5-6
• abstract6-10
• 第一章 文献综述10-22
• 1.1 苦荞简介10
• 1.2 芦丁的研究进展10-12
• 1.2.1 芦丁的概况10
• 1.2.2 芦丁的药理研究进展10-12
• 1.3 降解芦丁相关酶的研究进展12-17
• 1.3.1 α-L鼠李糖苷酶的研究进展12-13
• 1.3.2 β 糖苷酶的研究进展13-15
• 1.3.3 β 糖苷酶的底物特异性及催化机制的研究15-16
• 1.3.4 β 糖苷酶的分子研究和重组表达16-17
• 1.4 毕赤酵母表达系统17-18
• 1.5 基因多样性形成的原因18-20
• 1.5.1 外显子的改变18-19
• 1.5.2 内含子多样性及其研究进展19-20
• 1.5.3 可变剪接（AS）20
• 1.6 展望20-21
• 1.7 研究目的意义21-22
• 第二章 芦丁降解酶基因组DNA多态性分析22-28
• 2.1 实验材料22
• 2.1.1 菌株22
• 2.1.2 工具酶与主要试剂22
• 2.2 实验方法22-24
• 2.2.1 苦荞基因组DNA提取22
• 2.2.2 引物设计22-23
• 2.2.3 RDE基因组DNA多态性克隆测序23
• 2.2.4 转化子的筛选与鉴定23-24
• 2.2.5 测序鉴定24
• 2.3 实验结果24-27
• 2.3.1 RDE基因组DNA克隆24-27
• 2.4 讨论与分析27-28
• 第三章 一种快速纯化苦荞籽粒芦丁降解酶的方法28-34
• 3.1 实验材料28
• 3.2 实验方法28-31
• 3.2.1 不同浓度甲醇溶剂对芦丁降解酶粗酶液提取及活性的影响28-29
• 3.2.2 芦丁降解酶粗酶液SDS-PAGE检测29
• 3.2.3 Native-PAGE酶谱法检测芦丁降解酶的活性。29-30
• 3.2.4 紫外分光光度计法检测芦丁降解酶粗酶液活性30
• 3.2.5 芦丁降解酶的提取方法优化30
• 3.2.6 芦丁降解酶的纯化30-31
• 3.3 实验结果与分析31-33
• 3.3.1 SDS-PAGE检测不同浓度甲醇溶剂对芦丁降解酶粗酶液提取的影响31
• 3.3.2 Native PAGE酶谱检测不同浓度甲醇溶剂对芦丁降解酶粗酶液活性的影响31-32
• 3.3.3 紫外分光光度计法检测芦丁降解酶粗酶液活性32
• 3.3.4 芦丁降解酶的纯化32-33
• 3.4 讨论与分析33-34
• 第四章 芦丁降解酶在毕赤酵母中的重组表达及纯化34-41
• 4.1 实验材料34
• 4.1.2 工具酶与主要试剂34
• 4.1.3 试剂配制34
• 4.2 实验方法34-37
• 4.2.1 pPICZα A-rde分泌表达载体构建34-35
• 4.2.2 重组质粒转化35-36
• 4.2.3 重组转化子的表达分析36
• 4.2.4 目的蛋白纯化36-37
• 4.2.5 重组蛋白糖基化分析及与天然蛋白大小比较分析37
• 4.3 结果与分析37-39
• 4.3.1 重组质粒的构建和鉴定37-38
• 4.3.2 转化子PCR鉴定38
• 4.3.3 重组蛋白表达及纯化分析38-39
• 4.3.4 重组蛋白糖基化分析及与天然蛋白大小比较分析39
• 4.4 讨论与分析39-41
• 第五章 芦丁降解酶的催化特性分析41-46
• 5.1 材料与试剂41
• 5.1.1 实验材料41
• 5.1.2 主要试剂配制41
• 5.2 实验方法41-42
• 5.2.1 RDE蛋白含量测定41
• 5.2.2 RDE酶活测定41-42
• 5.3 实验结果42-44
• 5.3.1 不同反应时间对芦丁降解酶活性的影响42
• 5.3.2 pH对酶活性的影响42-43
• 5.3.3 温度对酶活性的影响43-44
• 5.3.4 RDE动力学参数Km和Vmax44
• 5.4 讨论与分析44-46
• 第六章 结论与展望46-48
• 6.1 结论46
• 6.2 展望46-48
• 参考文献48-56
• 附录56-60
• 致谢60-61
• 作者简介61

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