大熊猫犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

发布时间：2017-07-15 19:31

  本文关键词：大熊猫犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

  更多相关文章： 重组山羊痘病毒 同源重组 犬瘟热病毒 H基因 F基因

【摘要】：犬瘟热(Canine Distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。CDV的感染呈世界性分布,并且可以在不同的物种间进行传播,除感染犬科外,浣熊科、大灵猫科以及猫科的部分成员均易感,动物感染CDV后,表现多样的临床症状,且容易继发其他病原微生物的感染,部分野生动物如小熊猫死亡率高达100%。近年来,随着CDV的不断变异和进化,CD的宿主范围不断地扩大,已经有大熊猫、小熊猫、虎以及狮等野生动物感染CDV的报道。目前,宠物犬瘟热的预防主要依靠传统的弱毒疫苗,虽然某些野生动物使用宠物传统的弱毒疫苗在控制CDV上有一定作用,但对于大熊猫、小熊猫、黑蹄臭鼬等野生动物而言,其安全性和免疫效果均有很大的不足。因此,为了解决野生动物CD的免疫预防的问题,同时解决宠物弱毒疫苗毒力可能返强等问题,开发和研制更加安全、高效的新型犬瘟热活载体疫苗具有重要的意义。CDV是副黏病毒科、麻疹病毒属成员,CDV囊膜表面的血凝素蛋白(H)与融合蛋白(F)是诱导中和抗体的主要抗原。由于山羊痘病毒(Goatpox Virus)存在复制缺陷性,故在哺乳动物中为一过性感染,具有宿主限制性,安全性很高。因此山羊痘病毒是构建表达犬瘟热H与F基因重组疫苗的理想载体。本研究参照GenBank上已公布的大熊猫CDV H与F编码的基因序列,对其抗原保守结构和识别区域进行修饰,由北京六合华大基因公司合成,在已有pMDTK-PEL-EGFP载体的基础上,将CDV保护性抗原H、F基因分别克隆到pMDTK-pEL载体中,然后运用酶切、连接将表达盒PELH、PELF分别构建到pTK-Eg载体中,从而获得重组转移载体质粒pTK-H-Eg与pTK-F-Eg。分别将重组转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg与GTPV AV41株共转染仓鼠肾细胞(BHK细胞),使其在细胞内发生同源重组,获得重组CDV的H、F基因的山羊痘病毒,然后在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)上加压筛选,利用gpt培养基筛选到稳定表达EGFP的重组病毒。通过PCR、绿色荧光以及Western blot鉴定,证明CDV的H、F基因成功构建到GTPV基因组中,并且在细胞中均获得了正确表达,将获得的重组病毒分别命名为vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg。这些工作为犬瘟热基因重组疫苗研制打下了初步的基础。
【关键词】：重组山羊痘病毒 同源重组 犬瘟热病毒 H基因 F基因
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-5
• 英文缩写对照表5-11
• 前言11-20
• 1 犬瘟热病毒概述11-19
• 1.1 犬瘟热病毒的分子生物学特征11-13
• 1.1.1 CDV的分类与形态结构11-12
• 1.1.2 CDV基因组结构与功能12-13
• 1.1.2.1 融合蛋白（F）12-13
• 1.1.2.2 附着或血凝蛋白（H）13
• 1.1.2.3 核衣壳蛋白（N）13
• 1.1.2.4 其他结构与非结构蛋白13
• 1.2 犬瘟热的流行病学13-14
• 1.3 犬瘟热的致病机理14
• 1.4 犬瘟热的临床症状与病理变化14-15
• 1.5 犬瘟热的诊断方法15
• 1.5.1 病毒的分离15
• 1.5.2 抗原检测15
• 1.5.3 病毒核酸的检测15
• 1.5.4 血清学诊断15
• 1.6 犬瘟热的预防与控制15
• 1.7 犬瘟热疫苗的研究进展15-17
• 1.7.1 亚单位疫苗16
• 1.7.2 DNA疫苗16-17
• 1.7.3 重组活载体疫苗17
• 1.8 山羊痘病毒载体研究进展17-19
• 1.8.1 GTPV的基本特征17-18
• 1.8.2 GTPV的基因组18
• 1.8.3 GTPV载体的构建技术18-19
• 1.9 GTPV载体的应用19
• 2 研究目的和意义19-20
• 第一章 犬瘟热重组山羊痘病毒转移载体pTK-H-Eg与pTK-F-Eg构建与鉴定20-40
• 1 引言20
• 2 材料与方法20-34
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 质粒20
• 2.1.2 试剂和试剂盒20
• 2.1.3 主要仪器设备20-21
• 2.2 方法21-34
• 2.2.1 主要试剂的配制21
• 2.2.2 基因的合成21-22
• 2.2.3 引物设计与合成22
• 2.2.4 转移载体骨架的pMDTK-PEL的构建22-26
• 2.2.4.1 转移载体质粒pMDTK-PEL-EGFP酶切与回收22-23
• 2.2.4.2 转移载体质粒pMDTK-PEL-EGFP补平与回收23-24
• 2.2.4.3 转移载体质粒pMDTK-PEL-EGFP补平后的酶切与回收24
• 2.2.4.4 转移载体pMDTK-PEL的自身环化连接24-25
• 2.2.4.5 DH5α感受态细胞的制备25
• 2.2.4.6 连接产物pMDTK-PEL转化DH5α感受态细胞25-26
• 2.2.4.7 重组质粒pMDTK-PEL的小量抽提26
• 2.2.4.8 重组质粒pMDTK-PEL的序列测定26
• 2.2.5 重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF的构建26-28
• 2.2.5.1 目的基因H、F与载体pMDTK-PEL连接28
• 2.2.5.2 连接产物pMDTK-PELH与pMDTK-PELF转化DH5α感受态细胞28
• 2.2.5.3 重组质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF的小量抽提28
• 2.2.5.4 重组质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF的序列测定28
• 2.2.6 重组转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的构建28-34
• 2.2.6.1 转移载体质粒pMDTK-PELH酶切与回收28-29
• 2.2.6.2 转移载体质粒pMDTK-PELH补平与回收29
• 2.2.6.3 表达盒PELH的获得29-30
• 2.2.6.4 转移载体质粒pMDTK-PELF酶切与回收30
• 2.2.6.5 转移载体质粒pMDTK-PELF补平与回收30
• 2.2.6.6 表达盒PELF的获得30-31
• 2.2.6.7 表达盒PELH、PELF与载体pTK-Eg连接31
• 2.2.6.8 连接产物pTK-H-Eg和pTK-F-Eg转化DH5α感受态细胞31
• 2.2.6.9 重组质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的小量抽提31
• 2.2.6.10 重组质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的序列测定31-34
• 3 结果与分析34-38
• 3.1 载体质粒pMDTK-PEL的构建结果34
• 3.2 重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF的构建结果34-35
• 3.3 重组转移载体质粒pTK-H-Eg与pTK-F-Eg的构建结果35-38
• 4 讨论38-40
• 4.1 目的基因H、F的选择38
• 4.2 重组山羊痘病毒转移载体的构建38-40
• 第二章 犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒的构建与鉴定40-54
• 1 引言40
• 2 材料与方法40-48
• 2.1 材料40-41
• 2.1.1 细胞和毒株40
• 2.1.2 试剂和试剂盒40-41
• 2.1.3 主要仪器设备41
• 2.2 方法41-48
• 2.2.1 常用试剂溶液的配制41-42
• 2.2.2 SDS-PAGE和Western blot所需的试剂和溶液42
• 2.2.3 引物设计与合成42-43
• 2.2.4 无内毒素重组质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的中量制备43
• 2.2.5 Vero、BHK细胞的复苏、传代及冻存43-44
• 2.2.6 原代犊牛睾丸（bovine testicle，BT）细胞的制备44-45
• 2.2.7 山羊痘病毒GTPV AV41的增殖及滴度的测定45
• 2.2.8 重组GTPV的制备、纯化和鉴定45-47
• 2.2.8.1 同源重组45-46
• 2.2.8.2 重组病毒的加压筛选和纯化46-47
• 2.2.9 重组病毒vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg的Western blot鉴定47-48
• 3 结果与分析48-52
• 3.1 GTPV AV41滴度的测定结果48
• 3.2 重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg的制备结果48-49
• 3.3 重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg纯化的结果49-50
• 3.4 重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg鉴定的结果50-51
• 3.5 重组病毒vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg的Western blot结果51-52
• 4 讨论52-54
• 4.1 山羊痘病毒活载体的选择52-53
• 4.2 重组山羊痘病毒的构建与鉴定53
• 4.3 表达产物的检测53-54
• 全文总结54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-61
• 附录61-65

，

本文编号：545450