热带假丝酵母单糖转运蛋白基因的克隆鉴定及功能研究

发布时间：2017-07-15 18:35

  本文关键词：热带假丝酵母单糖转运蛋白基因的克隆鉴定及功能研究

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【摘要】：能源是人类生存和发展的物质基础,其中液体形态的燃料石油已成为现代文明赖以生存的“血液”。然而,地球上的石油资源有限,并呈现枯竭之势。为了寻求替代资源,人们把目光集中到了生物燃料乙醇上。目前,国内外最为关注的是以木质纤维素水解液为原料发酵生产乙醇。该水解液中主要包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖等六碳糖,以及木糖和少量阿拉伯糖等五碳糖。然而,乙醇发酵最为优良的酿酒酵母不能对上述这些木质纤维素水解单糖进行全组分利用,所以必须对其进行基因工程改造。其中,单糖的跨膜转运是决定糖是否能被酿酒酵母代谢利用的第一步,也被认为是最为关键的一步。因此,发掘优良的单糖转运蛋白并对它们进行功能研究显得尤为重要。本实验以具有优良糖代谢能力的热带假丝酵母SHC-03(Candida tropicalisSHC-03)为研究材料,首先研究了它对不同单糖的利用能力；其次,根据KEGG数据库中的基因预测及注释结果,从全基因组6254个功能基因中筛选出了15个可能具有糖转运蛋白功能的基因作为研究对象,将这些基因在酿酒酵母工程菌中实现了异源表达,进行了功能互补实验；然后,分析了热带假丝酵母菌体内的这些基因在木糖、葡萄糖以及混合糖源条件下的转录变化；最后,对鉴定出的单糖转运蛋白进行了结构预测及系统进化分析。该研究获得了以下结果：(1)通过对热带假丝酵母在不同糖源条件下的生长分析,发现热带假丝酵母具有较广的糖源利用能力。它不仅可以很好地利用六碳糖中的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等,而且还能利用五碳糖中的木糖以及二糖中的蔗糖和纤维二糖等。从热带假丝酵母6254个功能基因中预测筛选出了15个目的基因,对它们进行了克隆并构建表达载体,转入一株敲除所有单糖转运蛋白基因但引入了木糖代谢途径的酿酒酵母(S. cerevisiae YXI)中进行功能互补验证,结果发现在15个候选基因中,CTRG_00554, CTRG_01164,CTRG_01165,CTRG_01648和CTRG_04615这5个基因表现出糖转运蛋白基因的功能,被鉴定为新的糖转运蛋白基因。通过分析克隆表达菌株生长速率的差异,发现不同的糖转运蛋白表现出对不同单糖转运的偏好性。这5个糖转运蛋白均可以转运葡萄糖、果糖和木糖,其中CTRG_01648p对葡萄糖和木糖的转运能力最强,CTRG_01164p对果糖的转运能力最强。CTRG_00554p,CTRG_01648p和CTRG_04615p可以转运除了核糖以外本实验中的所有单糖：CTRG_00554p对木糖和甘露糖的利用能力较好；CTRG_01648p和CTRG_04615p为高效的糖转运蛋白,对葡萄糖、甘露糖、果糖和木糖均有较强的转运能力,而且CTRG_01648p转运这4种糖的能力均明显优于对照ScHXT7p。本实验未发现专一的木糖转运蛋白。(2)在木糖、葡萄糖和混合糖三种条件下,本实验对15个候选基因的表达水平进行了研究。结果表明CTRG_00554, CTRG_01165, CTRG_01322, CTRG 01648, CTRG_02338, CTRG_03572, CTRG_04303和CTRG_06250等8个基因在三种条件下均被诱导表达,其中CTRG_00554和CTRG_04303在木糖条件下的表达量比在葡萄糖条件下的表达量高15倍以上,表现出显著的木糖诱导表达。CTRG_01164p和CTRG_04615p虽然表现出对葡萄糖和木糖的转运能力,但是这两个基因在木糖、葡萄糖和混合糖三种条件下的表达量均无升高。CTRG_01322, CTRG_02338, CTRG_03572, CTRG_04303和CTRG_06250等5个无糖转运功能的基因也表现出了诱导表达,它们的具体功能有待进一步研究。(3)15个候选糖转运蛋白结构的预测表明,它们的结构均符合MFS(Major facilitator superfamily)超家族的特点。以最大似然法将它们与目前已知的糖转运蛋白进行蛋白序列比对并构建系统发育树,聚类结果显示15个候选蛋白中有糖转运蛋白功能的5个蛋白被分成了三组。结合前人的报道发现A、B、C这三组糖转运蛋白在结构和功能上有各自的特点。本论文研究以热带假丝酵母SHC-03为研究对象,通过在酿酒酵母中的克隆表达及功能互补验证,成功地从15个候选基因中鉴定出5个未见报道的酵母单糖转运蛋白基因。不同的转运蛋白基因对所测定的单糖表现出不同的转运能力和转录应答差异。个别基因具有较强的转运多种单糖的能力。本论文取得的成果丰富了酿酒酵母基因改造的资源库,使我们对酵母菌糖转运蛋白的特点有了更深入的认识。对今后提高木质纤维素燃料乙醇的生产效率具有重要的意义。
【关键词】：热带假丝酵母 糖转运蛋白 木质纤维素 燃料乙醇
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q93
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 文献综述11-23
• 1. 引言11-13
• 2. 酵母单糖转运蛋白国内外研究进展13-19
• 2.1 酵母单糖转运蛋白13-14
• 2.2 酵母单糖转运蛋白的来源及分类14-15
• 2.3 酵母单糖转运蛋白的转运机制及表达调控15-18
• 2.4 酵母单糖转运蛋白的分子改造及应用18-19
• 3. 热带假丝酵母的研究进展19-21
• 4. 本实验的研究内容及意义21-22
• 5. 技术路线22-23
• 第二章 热带假丝酵母全基因组中单糖转运蛋白的筛选23-50
• 1. 实验方案23-40
• 1.1 材料与试剂23-27
• 1.1.1 本实验中所使用的菌种和质粒23-24
• 1.1.2 常用生化试剂24-25
• 1.1.3 常用分子生物学试剂、酶及试剂盒25-26
• 1.1.4 主要仪器与设备26-27
• 1.1.5 培养基及配方27
• 1.2 热带假丝酵母在不同单糖条件下的生长测试27-28
• 1.3 热带假丝酵母全基因组中单糖转运蛋白的筛选28-31
• 1.4 热带假丝酵母糖转运蛋白基因的糖利用能力分析31-37
• 1.4.1 在S cerevisiaeEBY.VW4000中转入木糖异构酶基因31
• 1.4.2 单糖转运蛋白表达载体的构建31-35
• 1.4.3 获得功能互补菌株S.cerevisiaeXI-1～S cerevisiaeXI-1535-36
• 1.4.4 单糖转运蛋白进行功能分析36-37
• 1.5 本章中各试剂盒的使用方法37-40
• 1.5.1 酵母菌基因组DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.~(TM) Yeast DNA Kit)37-38
• 1.5.2 质粒DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.~(TM) Plasmids DNA Kit)38-39
• 1.5.3 PCR产物胶回收试剂盒(E.Z.N.A.~(TM) Gel Extraction Kit)39
• 1.5.4 PCR产物纯化试剂盒(E.Z.N.A.~(TM) Cycle-Pure Kit)39-40
• 2. 结果与分析40-48
• 2.1 热带假丝酵母在不同单糖条件下的生长表现40-42
• 2.2 热带假丝酵母糖转运蛋白的筛选42-43
• 2.3 热带假丝酵母糖转运蛋白的糖利用能力分析43-46
• 2.4 具有单糖利用能力的重组菌株与热带假丝酵母在混合糖中的生长表现46-48
• 3. 讨论与小结48-50
• 第三章 目的基因在热带假丝酵母菌体内的转录水平分析50-61
• 1. 材料与方法50-56
• 1.1 菌株50
• 1.2 主要试剂及仪器50
• 1.3 qPCR引物50-53
• 1.4 RNA提取、纯化及cDNA的制备53-55
• 1.5 基因表达RT-qPCR分析55-56
• 2. 结果与分析56-60
• 2.1 样品RNA的获得56
• 2.2 基因表达RT-qPCR分析56-60
• 3. 讨论与小结60-61
• 第四章 单糖转运蛋白的结构预测与分析及系统进化树分析61-68
• 1. 实验方案61
• 1.1 糖转运蛋白二级结构与三级结构的预测61
• 1.2 预测的热带假丝酵母糖转运蛋白与已知的糖转运蛋白的系统进化树分析61
• 2. 结果与分析61-67
• 2.1 热带假丝酵母糖转运蛋白二级结构与三级结构的预测61-64
• 2.2 预测的热带假丝酵母糖转运蛋白与已知的糖转运蛋白的系统进化树分析64-67
• 3. 讨论与小结67-68
• 第五章 论文主要创新点及研究展望68-70
• 1. 主要创新点68-69
• 2. 展望69-70
• 参考文献70-75
• 基金项目75
• 研究生期间主要成果75-76
• 致谢76

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