大豆GmWRKYs基因的克隆和功能研究

发布时间：2017-07-16 01:11

  本文关键词：大豆GmWRKYs基因的克隆和功能研究

  更多相关文章： 酸性土壤 低磷胁迫 铝毒 GmWRKY 大豆

【摘要】：低磷和铝毒害是限制南方酸性土壤大豆生产的重要因子。植物WRKY转录因子是数量众多功能重要的转录因子家族之一,在调控植物适应逆境胁迫中起着重要作用。大豆基因组中含有至少127个WRKY家族成员,本研究通过生物信息学分析,筛选四个IIa型WRKY基因,并对其亚细胞定位、转录激活活性以及表达模式等性质进行了分析。根据所得结果,筛选出受低磷和铝毒共同调控的GmWRKY7进行初步的功能分析。主要结果如下:1)通过比对在大豆基因组中获得四个与拟南芥AtWRKY40高度同源的GmWRKY基因。根据这些基因在基因组上的位置,分别将其命名为GmWKRY7,GmWRKY8,GmWRKY13和GmWRKY15。这四个GmWRKY蛋白的N端均含有一个典型的WRKY结构,均属于IIa型WRKY转录因子。2)酵母单杂结果显示,这四个GmWRKY蛋白均无转录激活活性。进一步亚细胞定位结果显示,四个GmWRKY的亚细胞定位不同。其中GmWRKY7和GmWKRY8定位于细胞核;GmWRKY13定位于细胞核和质体;而GmWRKY15定位在质体内。3)对这些GmWKRY基因的表达模式分析结果显示,营养元素的缺乏对这四个基因在植株不同部位的表达均有不同程度的调控。其中,缺磷和缺铁上调了这四个GmWKRY在叶片和根系的表达水平。缺氮和缺硫均上调了这四个GmWKRY基因在叶片的表达量。但在根系中,缺氮上调了GmWKRY7和GmWRKY15的表达量,抑制了GmWRKY8的表达。缺硫则抑制了GmWKRY7和GmWRKY8的表达,对GmWRKY15的表达量无明显影响。缺钾除了抑制GmWRKY15在老叶的表达以外,均上调了各基因在各部位的表达。缺钙抑制了这四个基因在新叶以及GmWRKY15在老叶的表达,但提高了GmWKRY7和GmWRKY8在老叶和根系的表达,对于GmWRKY15在根系的表达量则无显著影响。4)激素调控了GmWKRYs基因的表达。其中,GA3、ABA和IAA能够瞬时提高GmWRKY7的表达水平;KT则瞬时抑制该基因的表达。GmWRKY8的表达水平在GA3和IAA处理条件下瞬时上调,但在6-BA和KT处理条件下受到明显抑制。另外,除ABA瞬时上调,6-BA和KT抑制GmWRKY15的表达水平以外,其他激素对该基因的表达无明显影响。5)铝处理能明显提高大豆根尖GmWRKY7,GmWRKY8和GmWRKY15的表达。与铝敏感基因型相比,耐铝基因型品种中铝调控的GmWRKY7的相对表达量较高,而铝调控的GmWRKY8和GmWRKY15的相对表达量较高。6)选取GmWRKY7进行下一步功能分析。酵母单杂分析结果显示GmWRKY7能够结合GmALMT1的启动子区域。在拟南芥中超量表达GmWRKY7,能够显著降低低磷胁迫下转基因拟南芥花青素的积累。综上所述本文研究系统分析了大豆四个IIa型GmWRKY转录因子的亚细胞定位,转录激活活性以及其编码基因的表达模式等特性,并初步分析了GmWRKY7在大豆适应铝毒和低磷胁迫中的生物学功能,为今后深入研究大豆GmWRKY转录因子的功能提供了有用信息。
【关键词】：酸性土壤 低磷胁迫 铝毒 GmWRKY 大豆
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S565.1
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 1 前言11-17
• 1.1 植物适应低磷胁迫机制的研究进展11-12
• 1.2 植物耐铝毒机制的研究进展12-14
• 1.3 WRKY转录因子家族调控植物适应低磷胁迫和铝毒害的研究进展14-16
• 1.4 本研究的目的和意义16-17
• 2 材料与方法17-32
• 2.1 本研究总体技术路线17-18
• 2.2 实验材料18-24
• 2.2.1 植物材料18
• 2.2.2 载体和菌株18-21
• 2.2.3 培养基及配方21-22
• 2.2.3.1 细菌培养基21
• 2.2.3.2 酵母单杂所用培养基21
• 2.2.3.3 MS培养基21-22
• 2.2.3.4 瞬时表达所用培养基22
• 2.2.4 主要试剂及配制22-24
• 2.2.4.1 抗生素和激素配方22-23
• 2.2.4.2 酵母转化配方23
• 2.2.4.3 琼脂糖凝胶电泳23
• 2.2.4.5 DNA抽提主要试剂23
• 2.2.4.6 RNA抽提主要试剂23-24
• 2.2.5 主要药品和试剂24
• 2.3 主要设备24-25
• 2.4 实验方法25-32
• 2.4.1 GmWRKY基因的克隆和生物信息学分析25
• 2.4.2 GmWRKY基因表达模式分析25-26
• 2.4.2.1 营养元素缺乏对GmWRKY基因表达的影响25
• 2.4.2.2 激素对大豆GmWRKY基因表达的影响25-26
• 2.4.2.3 铝毒害对GmWRKY基因表达的影响26
• 2.4.3 RNA的提取和反转录26-27
• 2.4.3.1 植物组织基因组RNA的提取26
• 2.4.3.2 植物组织基因组RNA的反转录26-27
• 2.4.4 实时定量PCR及其引物设计27
• 2.4.5 DNA的提取27-28
• 2.4.6 GmWRKY基因的表达载体构建28-29
• 2.4.6.1 GmWRKYs的Gateway系统的载体构建28
• 2.4.6.2 GmWRKYs的亚细胞定位载体pBEGFP构建28-29
• 2.4.6.3 GmWRKYs和GmALMT1启动子的酵母单杂载体构建29
• 2.4.7 大豆GmWRKY的亚细胞定位29-30
• 2.4.7.1 瞬时表达转洋葱表皮细胞29-30
• 2.4.7.2 瞬时表达转烟草表皮细胞30
• 2.4.8 拟南芥的转化与后代筛选30-31
• 2.4.9 拟南芥花青素含量测定31
• 2.4.10 数据统计及分析31-32
• 3 结果与分析32-49
• 3.1 大豆IIa型WRKY基因成员的生物信息学分析32-35
• 3.1.1 大豆GmWRKY的进化树和结构域分析32-35
• 3.2 大豆GmWRKY基因家族成员的生物学特性分析35-37
• 3.2.1 大豆GmWRKY的转录激活活性分析35
• 3.2.2 大豆GmWRKY的亚细胞定位分析35-37
• 3.3 大豆GmWRKYs基因表达模式分析37-44
• 3.3.1 营养元素的缺乏对大豆GmWRKYs基因表达模式的影响37-39
• 3.3.2 部分激素处理对大豆GmWRKYs基因表达模式的影响39-41
• 3.3.3 铝毒害对大豆GmWRKYs基因表达模式的影响41-44
• 3.3.3.1 铝毒害调控大豆GmWRKYs基因的表达41-42
• 3.3.3.2 铝调控的GmWRKYs表达的自然变异分析42-44
• 3.4 大豆GmWRKY7的功能研究44-49
• 3.4.1 大豆GmWRKY7与GmALMT1启动子相互作用的分析44-46
• 3.4.2 GmALMT1与GmWRKY7响应铝毒害的表达模式分析46-49
• 3.4.2.2 超量表达GmWRKY7对拟南芥响应低磷胁迫的影响46-49
• 4 讨论与结论49-54
• 4.1 大豆GmWRKY家族基因分析49-50
• 4.2 大豆GmWRKYs的表达模式分析50-51
• 4.3 GmWRKY与大豆铝毒适应性的关系51
• 4.4 GmWRKY与大豆低磷适应性的关系51-52
• 4.5 结论52-54
• 致谢54-56
• 参考文献56-61
• 附录61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 王保明;陈永忠;王湘南;陈隆升;彭邵锋;王瑞;马力;杨小胡;罗键;;植物低磷胁迫响应及其调控机制[J];福建农林大学学报(自然科学版);2015年06期

2 梁翠月;廖红;;植物根系响应低磷胁迫的机理研究[J];生命科学;2015年03期

3 胡可;韩科厅;戴思兰;;环境因子调控植物花青素苷合成及呈色的机理[J];植物学报;2010年03期

4 林郑和;陈荣冰;;植物铝毒及其耐铝机制研究进展[J];中国农学通报;2009年13期

5 张福锁;王激清;张卫峰;崔振岭;马文奇;陈新平;江荣风;;中国主要粮食作物肥料利用率现状与提高途径[J];土壤学报;2008年05期

6 王连铮,傅玉清,赵荣娟,王岚,裴颜龙,李强;黄淮海地区大豆育种的研究[J];大豆科学;2001年04期

7 李继云,刘秀娣,周伟,孙建华,童依平,刘文杰,李振声,王培田,姚树江;有效利用土壤营养元素的作物育种新技术研究[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1995年01期

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本文编号：546504