副溶血弧菌tdh2基因敲除、表达及调控机制研究

发布时间：2017-07-16 00:19

  本文关键词：副溶血弧菌tdh2基因敲除、表达及调控机制研究

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【摘要】：副溶血弧菌是革兰氏阴性嗜盐菌,主要分布在近海岸的海水、海产品以及盐渍食物中。它是一种食源性致病菌,生吃或者食用未煮熟的海产品会引起急性肠胃炎和败血症。TDH被认为是副溶血弧菌的重要致病因子,主要由tdh2基因编码。由致病性副溶血弧菌感染引发的食物中毒已经成为全球食品安全关注的一个重点。本文应用自杀载体p DS132通过同源重组的方式对副溶血弧菌RIMD2210633进行tdh2基因的敲除,并对tdh2基因进行了回补试验。从副溶血弧菌的流行病学特性出发,比较分析了tdh2敲除株与亲本株的生物学差异。并在此基础上初步探讨副溶血弧菌tdh2的表达和基因调控机制。论文主要研究内容和结果如下:1.副溶血弧菌tdh2敲除株和回补株的构建通过重叠PCR技术将tdh2基因编码区的上下游同源臂进行融合,克隆入自杀载体p DS132,并转化入大肠杆菌S17λpir中。通过接合转移的方法将重组质粒p DS132转移到副溶血弧菌RIMD2210633中,经第一轮及第二轮重组菌的筛选后获得副溶血弧菌tdh2敲除株。为了验证副溶血弧菌tdh2敲除株是否发生极性突变,本章对tdh2敲除株进行了tdh2基因的回补试验。将tdh2基因片段克隆入载体p ACYC184,通过电转化的方式将重组质粒转化到副溶血弧菌tdh2敲除株中,从而得到副溶血弧菌tdh2回补株。本章成功获得副溶血弧菌tdh2敲除株与回补株。2.副溶血弧菌tdh2敲除株的生物学特性研究致病性和非致病性副溶血弧菌在逆环境中的生存能力不同。为了研究tdh2对副溶血弧菌在逆环境中的生存能力是否产生影响,本章通过比较副溶血弧菌亲本株与tdh2敲除株在生长、蛋白表达、耐药性、耐酸、耐胆汁等生物学特性方面的差异性,来分析tdh2基因对副溶血弧菌的生物学特性的影响,结果发现在生长、耐药性方面,两者并没有显著性差异,而在蛋白表达、耐酸及耐胆汁方面两者具有显著性差异。tdh2敲除株与亲本株的菌体蛋白表达在29 KD附近以及29 KD与44.3 KD之间存在差异,其中一种差异性蛋白经质谱鉴定可能为细菌素C ABC转运ATP结合蛋白。副溶血弧菌亲本株比Vp:△tdh2更能够耐酸及耐胆汁。3.副溶血弧菌TDH表达及调控机制研究本章对tdh2基因进行了克隆,将tdh2基因片段连接到表达载体p GEX-4T-1上,通过大肠杆菌表达系统成功表达了TDH。同时,本章采用荧光定量PCR技术检测相关调控子m RNA的表达水平,以初步探讨tdh2基因的调控机制。结果发现与副溶血弧菌亲本株相比,tdh2敲除株中vp0301、vp1995、vp2553、vp1549、vpa1332、vpa1348、vp0527、vpa1361、vp2890、vpa1312和vpa313基因m RNA的表达水平具有显著变化,结果表明tdh2基因能够调控这11个基因,其中vp0301、vp1995、vp2553、vp1549、vpa1312和vpa313表达上调,vpa1332、vpa1348、vp0527、vpa1361和vp2890表达下调。本研究对副溶血弧菌的tdh2基因进行敲除,并对tdh2敲除株生物学特性进行分析,在此基础上初步探讨了tdh2基因的调控机制,为副溶血弧菌的致病机理以及毒力基因的调控机制研究奠定基础。同时,我们对TDH进行了原核表达,为在蛋白质水平上对副溶血弧菌TDH的研究及基因工程疫苗的研制奠定基础。
【关键词】：副溶血弧菌 tdh2毒力基因 生物学特性 TDH表达 基因调控
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 绪论11-22
• 1.1 副溶血弧菌简介11
• 1.2 副溶血弧菌的国内外研究现状11-19
• 1.2.1 副溶血弧菌的流行病学研究11-12
• 1.2.2 副溶血弧菌的分子生物学研究12-17
• 1.2.3 tdh基因调控的研究现状17-19
• 1.3 细菌基因敲除的研究现状19-20
• 1.3 研究的目的和意义20
• 1.4 主要研究内容20-22
• 第二章 副溶血弧菌tdh2敲除株和回补株的构建22-37
• 2.1 引言22
• 2.2 试验材料22-24
• 2.2.1 菌株和质粒22
• 2.2.2 主要试剂（盒）22-23
• 2.2.3 主要仪器23
• 2.2.4 引物23-24
• 2.3 试验方法24-30
• 2.3.1 菌种制备与保存24
• 2.3.2 副溶血弧菌tdh2敲除株的构建24-28
• 2.3.3 副溶血弧菌tdh2回补株的构建28-30
• 2.4 结果与分析30-36
• 2.4.1 副溶血弧菌tdh2敲除株的鉴定30-34
• 2.4.2 副溶血弧菌tdh2回补株的鉴定34-36
• 2.5 小结与讨论36-37
• 第三章 副溶血弧菌tdh2敲除株生物学特性研究37-50
• 3.1 引言37
• 3.2 试验材料37-38
• 3.2.1 副溶血弧菌样品37
• 3.2.2 主要试剂37-38
• 3.2.3 主要仪器38
• 3.3 试验方法38-42
• 3.3.1 溶血活性的测定38-39
• 3.3.2 生长曲线和活菌数的测定39
• 3.3.3 菌体及上清蛋白SDS-PAGE电泳39-41
• 3.3.4 药敏试验41
• 3.3.5 耐酸试验41
• 3.3.6 耐胆汁试验41-42
• 3.4 结果与分析42-48
• 3.4.1 溶血活性比较42-43
• 3.4.2 生长曲线和活菌数比较43-44
• 3.4.3 蛋白SDS-PAGE电泳分析44-45
• 3.4.4 药敏性比较45
• 3.4.5 耐酸性比较45-46
• 3.4.6 耐胆汁能力比较46-48
• 3.5 小结与讨论48-50
• 第四章 副溶血弧菌TDH的表达及调控机制研究50-62
• 4.1 引言50
• 4.2 试验材料50-52
• 4.2.1 菌株50
• 4.2.2 主要试剂50-51
• 4.2.3 主要仪器51
• 4.2.4 引物51-52
• 4.3 试验方法52-55
• 4.3.1 TDH的原核表达52-54
• 4.3.2 RT-PCR检测相关调控子的基因表达54-55
• 4.4 结果与分析55-60
• 4.4.1 TDH原核表达结果与分析55-57
• 4.4.2 RT-PCR检测结果与分析57-60
• 4.5 小结与讨论60-62
• 第五章 结论与展望62-64
• 5.1 主要结论62
• 5.2 展望62-64
• 致谢64-65
• 参考文献65-73
• 攻读硕士学位期间发表的论文及其他科研成果73

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