西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的克隆及特性分析

发布时间：2017-07-20 17:28

  本文关键词：西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的克隆及特性分析

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【摘要】：白刺属(Nitraria L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)的一个小属,主要生长在荒漠和半荒漠地区,具有较强的耐干旱、耐盐碱和抗风沙能力,所以研究白刺的耐盐机理,开发其耐盐基因资源可为农作物和林木的遗传改良提供理论和实验依据。高亲和钾离子转运蛋白(High affactive K+ transpoter, HKT)位于质膜上,调控植物重吸收钠离子,维持胞内稳定的Na+/K+平衡,从而提高植物耐盐性。植物在蒸腾拉力作用下将根部Na+通过木质部薄壁细胞向上运输,HKT1将茎木质部中过多的Na+经共质体途径卸载到韧皮部,再运输回根部,以防止地上部分Na+积累过多。本研究利用同源克隆技术分离了西伯利亚白刺(Nitraria sibirica Pall)高亲和钾离子转运蛋白基因(命名为NsHKTl)及其启动子序列,并对其表达特性进行了研究。结果表明：克隆了1866bp NsHKTl cDNA序列,包含1662bp的开放阅读框,在进化上与番茄(茄科)S1HKT1蛋白具有较近的亲缘关系。利用Tail-PCR技术克隆了943bp NsHKT1启动子序列,对其进行生物信息学分析结果显示,NsHKTl启动子区域含有2个干旱脱水响应元件(ACGTATERD1)、1个盐诱导元件(GT1GMSCAM4)、1个低温响应元件(LTRE1AVBLT49)、4个生长素响应元件(CATATGGMSAUR)等,表明NsHKT1基因的表达可能受环境及生长发育因子的调控。实时荧光定量结果显示,NsHKT1基因在白刺茎中表达量高于在根和叶中的表达量,在受低温、NaCl和干旱胁迫时其表达量明显上调。为了进一步研究NSHKT1基因功能及异源表达特性,分别构建了pORE-NsHKT1::GUS、 pBI101-NsHKT1真核表达载体及pET-32a(+)-NsHKT1原核表达载体。真核表达载体利用农瘤杆菌介导的花序浸染法对拟南芥进行遗传转化。转基因植物表分析结果显示,NsHKT1启动子引导的GUS蛋白主要表达在转基因拟南芥叶脉中,与其将木质部中过多的Na+经共质体途径卸载到韧皮部的功能相一致。盐胁迫下超表达NsHKT1转基因拟南芥长势优于野生型植株。原核表达载体导入大肠杆菌中,超表达NsHKT1基因大肠杆菌抵御非生物胁迫分析显示,盐、干旱、冷胁迫下其生长优于非转基因菌株。本研究成果为分析NsHKT1表达特性、功能及作用机理,及利用该基因改良农作物和林木的耐盐性提供理论和试验依据。
【关键词】：西伯利亚白刺 高亲和钾离子转运蛋白 基因克隆 启动子 表达特性
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 本文所使用的缩略词表10-13
• 第一章 文献综述13-21
• 1.1 国内外研究现状13-19
• 1.1.1 盐胁迫对植物的危害及植物耐盐机理13-14
• 1.1.2 HKT基因研究进展14-19
• 1.2 研究意义及研究技术路线19-21
• 1.2.1 研究意义19-20
• 1.2.2 研究技术路线20-21
• 第二章 西伯利亚白剌HKT1 cDNA全长克隆及生物信息学分析21-35
• 2.1 材料和方法21-29
• 2.1.1 植物材料及培养21
• 2.1.2 实验试剂及其配制21-22
• 2.1.3 NsHKT1基因的克隆22-25
• 2.1.4 RACE技术克隆NsHKT1基因末端序列25-29
• 2.1.5 NsHKT1基因的生物信息学分析29
• 2.2 结果和分析29-35
• 2.2.1 RNA的凝胶变性电泳结果29-30
• 2.2.2 NsHKT1基因序列的克隆30
• 2.2.3 NsHKT1基因末端序列的克隆30-31
• 2.2.4 cDNA全长的克隆31
• 2.2.5 NsHKT1基因生物信息学分析31-35
• 第三章 西伯利亚白刺HKT1基因的表达特性分析35-49
• 3.1 材料和方法35-43
• 3.1.1 NsHKT1基因的表达特性分析35-37
• 3.1.2 NsHKT1基因启动子序列克隆及分析37-39
• 3.1.3 pORE R1-pNsHKT1::GUS表达载体的构建39-41
• 3.1.4 拟南芥遗传转化、筛选、鉴定41-42
• 3.1.5 NsHKT1：：GUS蛋白的检测42-43
• 3.2 结果和分析43-49
• 3.2.1 NsHKT1基因的表达特性分析43-44
• 3.2.2 NsHKT1基因启动子序列克隆和功能元件分析44-46
• 3.2.3 pORE R1-pNsHKT1：：GUS表达载体的构建46-47
• 3.2.4 拟南芥遗传转化、筛选、鉴定47-48
• 3.2.5 NsHKT1：：GUS蛋白的检测48-49
• 第四章 西伯利亚白刺HKT1基因的功能分析49-63
• 4.1 材料和方法49-55
• 4.1.1 pET-32a(+)-NsHKT1载体的构建49-53
• 4.1.2 pBI101-NsHKT1载体的构建53-55
• 4.2 结果和分析55-63
• 4.2.1 pET-32a(+)-NsHKT1载体的构建55-56
• 4.2.2 大肠杆菌的转化及鉴定56
• 4.2.3 NsHKT1蛋白的诱导表达56-57
• 4.2.4 转基因大肠杆菌的抗逆性检测57-60
• 4.2.5 pBI101-NsHKT1载体的构建60
• 4.2.6 拟南芥遗传转化、筛选、鉴定60-61
• 4.2.7 转基因植株的耐盐性分析61-63
• 第五章 讨论63-66
• 5.1 NsHKT1基因的分子特性63
• 5.2 NsHKT1基因的表达特性63-64
• 5.3 NsHKT1基因在大肠杆菌中的表达及抗逆性分析64-65
• 5.4 NsHKT1基因在拟南芥中的表达及耐盐性分析65-66
• 第六章 结论66-67
• 参考文献67-74
• 附录74-75
• 附录 白刺NsHKT1基因cDNA及推测的氨基酸序列74-75
• 致谢75

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本文编号：569215